Способ определения свободного связанного холестерина в биологических жидкостях Советский патент 1978 года по МПК G01N33/16 

потенщюметрпчески, пол;;рографпческ11 ii колориметрически, а также ферментативным способом. Наиболее предпочтителен срерментативный сиособ при использовании каталазы или пероксидазы, поскольку этот способ характеризуется не только чрезвычайной специфичностью п получением достоверных результатов, но и может быть скомбинирован с основной реакцией при образовании перекиси водорода.

Особенно подходяш,им является сиособ определения с помощью .каталазы в пр исутствии такого р-дикетона, как например, ацетилацетон и в присутствии таких низш ;х fv:oHo- пли полифункциональпых а.шф тнчссхпх спиртов, как метиловый сиирт, этиловый сиирт или мстпленгликоль, а также способ определения с помощью перокспдазы в присутствии хромогеиа. При осуществлении способа определения в присутствии каталазы, адетилацетона и метилового спирта последний окисляется в формальдегид, дающий с ацетилацетоиом цветную реакцию, по которой может быть произведено определение. При определении с помощью пероксидазы в качестве хромофора добавляют соединения, которые после ироведеиия реакции могут быть определены фотометрически. Примером подходящего хромофора является 2,2-амииобепзтиазолинсульфокислота.

Определение холестенона производят с помощью кетореагента, преимущественно с помощью таких производных гидразина, взанмодействующнх с кето-группой с образоваиием гндразонов, как например, 2,4динитрофеннлгидразин. Однако холестенО)может быть также определен непосредственно измерением интенсивности абсорбцн ; в области 240 им.

Пример 1. Поляриметрическое онре. деление расхода кислорода.

Применяют приспособление, которое состоит из реакционного сосуда в виде цилиндрической камеры из трансиарентной пластмассы с внутренним диаметром 143 мм и внутренней высотой 220 мм. Камера содержит 1.8 мл раствора 18 ммоль иодида калия, 7,5 ммоль гептамолибдата аммония, 800 ммоль хлорида натрия и 2 f/ холестериноксидазы в 0,2 моль буфера фосфата калия рН 6,0. В реакционном сосуде находится детектор, который состоит из кислород-сенситивного электрода . Детектор связан с анализатором. На дне реакционного сосуда находится магнитная мешалка. Чепез отверстие для наполнения добавляют 20 мл водного, содержащего холестеригг, раствора в качестве пробы. Во время энепгичного вращення магнптной мещалки замеряют уменьшение концентрации кислорода в растворе. Поглощение кислорода, которое наблюдают через 2,5 минуты реакции, отОиыт был иовторен при применении иробы сыворотки, омыленной с помощью спиртовой щелочп КОН. Определение дало коицентрацпю 193 мг холестерина на 100 мл. Сравнительное значение по Либерману - Бурхарду дало 182 лгг/100 мл.

П р н м е р 2. Определение Н2О2.

10 г кислого фосфата аммония растворяют в 100 мл воды и добавлением 8.5%-иой фосфорной кислоты устанавливают значение рН раствора 7.0. Затем добавляют 10 и каталазы. Полученным таким образом раствором смесь 0,2 мл апетилапетона и 10 мл метанола дополняют до 100 мл.

7,5 МЛ- полученного таким образом раствора смешпвают с 0,5 м.л сыворотки или 0,5 мл стаидартного раствора холестерииа с содержанием 200 мг % холестерина. Алпквот, содержащий сыворотку пробы, а также солсржапдий холестерин пробы, смешивают с 5 и холестериноксидазы и 0,02 мл 10%пого раствора оксиполиоксидоде а:га и инкубируют в течение 70 минут при 37° С.

Затем замеряют фотометрически образовавшийся краситель при 405 нм, иринимая во випманпе значение при отсутствил реагентов. Со стандартным раствором холестерина получают стандартную кривую, па стандартной кривой концентрация холсстеппна соотнесена к экстинкции при 405 нм.

Содержаипе холестерипа, содержапего сыворотку пробы, определяют при использовании стандарта в качестве стандартной величины. Контрольные определения но Лнберману - Бурхарду далп отклонения около 5%.

П р и м е р 3. Определение Н2О2.

К 3 мл буфера фосфата калия рН 7 (насыщенный 02), который содержит 100 мг % 2,2-аминобензтиазолинсульфокислоты, добавляют 100 мл 20%-пого раствора оксиполиэтоксидодекана и 0,02 мл ( 36 и) раствора пероксидазы, а также 0,02 мл Н202 (0,02 мл 30%-ного Н202 на 100 мл воды) до удаления восстановлеиных веществ. Смесь проходит в фотометр при 405 нм НЛП 436 нм. Как только реакция подходит к спокойному состоянию, начинают с 0,01 мл сывороткн (1 : 15 разбавлена водой). Через 10 минут добавляют 0,15 t/холестериноксидазы. Через последующие 10 минут отсчитывают разницу экстинкции.

Таким образом, однако при применении стандартного раствора холестерина с содержанием холестерина 200 мг составляют стандартную кривую. С помощью стандартной кривой определяют содержание холестерина пробы сыворотки. Измерения даю г содержание 180 мг % холестерина. Контрольное измерение по Либерману - Bvp. харду дает 185жг %.

Пример 4. Определение холестенона.

0,2 мл сыворотки (1 : 10 разбавлена водой) смешивают с 0,05 мл 20%-ного раст.тестериноксидазы. Через 15 минут 2,0 j;. раствора, содержащего 1 ммоль 2,4-дин11грофеиилгндразина добавляют в 1 н. соляную кислоту. Через последующие 30 минут добавляют 4,0 мл воды и замеряют образоса,шийся гидразон при 405 нм в фотомет с Оценку проводят в зависимости от стапдартпой кривой, принимая во внимание образец без реагента. 1-1змерение можно проводить также нри 546 нм после добавления щелочи.

Измерение в стандартной (типичной) пробе дает 60 мг % свободного холестерина и 54 мг % общего холестерина (омыление спиртовым раствором КОН).

Сравнительное определение по Либерману - Бурхарду дало 170 мг % обще; i холестерина.

Для омыления этерифицированного холестерина (измерение общего холестерина в сыворотке) смешивают 1 мл сыворотки, 1 мл 20%-ного раствора оксиполиэтоксидодекаиа и 5 м.л 0,5 н. КОН в 90%-иом этаноле и нагревают в течение 30 минут, до 70° С. Затем раствор оставляют охлаждаться, смешивают с 10 мл 0,1 М растворе сульфата магния и центрифугируют. Отстой (13 мл) содер}кит весь холестерин в свободном виде.

Омыление этерифицированного холестерииа леберэстеразой или холестериноэстеразой нроисходит в результате ЗО-минутно инкубации сыворотки при 37° С и рН 6-8.

П р и м е р 5. 0,2 мл сыворотки добавляют к 2,5 мл 0,5 н. буфера фосфата натрич рН 7,5 € 0,4% оксг;пол} этоксидодекана. Определяют экстинкцию при 240 нм в подходящем спектрофото-метре и начинают реакцию с 0,02 мл (1,5L) холестериноксидазы.

Через 2 минуты снова опреде.чяют экстинкцию. Концентрация образозавшегося холестенолг. образом холестерина получается Ил ;-аз:и ць :Ле.)зым и вторым T 3Me ;:ieM поп учете молярного коэффицпемта экстилкиип для холесте;юнг нрл 240 нм.

Измерен:1е тип1:чной пробы дало 58 .-j % сзободкого холестерина и 163 мг % общего холестерина (после омыления) .

С.ргвнительное определение по Либерману-Бурхарду дало 173 мг % общего холестерина.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую специфичность и точность определения свободного и связа1п;ого холестерина 3 биологическг.х жидкостях.

Ф о Р м у л а п 3 о б р е т е и и я

Способ определения свободного и сзя3aiii;o:0 холестерина в биологических Ж1 Дкостях, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью увеличения спеппфичностп и точности эпределекия, в б1:ологическую жидкость добавляют фермент холестерииокс дазу и оцредсляют свободпый холестерин по количеству поглощенного кислорода или выделившейся церекиси водорода, пли по количеству образовавщегося холеетенона, а связанный холестерин предварптельно переводят в свободную форму путем фер: 1ентного или щелочного г-идролиза.

Источник 1иформации, принятый во внимаиие при экспертизе:

1. Нредтеченский В. Е. Руководство по клиничским лабораторным псследованпям.