Способ определения холестерина Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 G01N33/92 C12Q1/60 C12Q1/28 C12Q1/46 

Изобретение относится к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследованиях при диагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторых инфекционных заболеваний.

Известен также способ определения холестерина, основанный на измерении скорости выделения пероксида водорода. Определение холестерина данным способом, который по своей сути наиболее близок к заявляемому изобретению, выполняется следующим образом. Аликвота исследуемого образца, например сыворотки крови, вносится в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующего состава: Буферная смесь 0,1 М, рН 5-9 Субстраты пероксидазы Соли желчных кислот 1-20 мМ, Неионные детергенты - 0,1-10 г/л Холестеринэстераза 100 - 30000 ед/л Холестериноксидаза 100 - 30000 ед/л

Пероксидаза2500 ед/л. Далее проводят регистрацию изменения оптической плотности при температуре 20- 40°С в течение 2-15 мин.

Недостатки рассматриваемого способа определения холестерина заключаются в следующем.

Оптимальные условия проведения реакций гидролиза и окисления не идентичны (не совпадают оптимум рН, температурный оптимум, концентрации детергентов), что приводит к использованию больших количеств ферментов.

Проведение определения холестерина рассматриваемым способом основано на одновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемых образцах содержится как этерифицирован- ный, так и неэтерифицированный холестерин, причем соотношение .этих форм холестерина может меняться в зависимости отсыворотки. Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холе- стеринэстеразой зависит от длины и

ел

С

vj

00

00

4

о VJ

степени насыщенности остатка жирной кислоты. Поэтому начальная скорость образования пероксида водорода зависит не только от общей концентрации холестерина, но и от соотношения разных форм холестерина в образце, что приводит к снижению точности определения.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Поставленная цель достигается предложенным способом, заключающимся в том, что исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации состава: не менее 0,01 м/л буфера с рН 6,5-8,0; не менее 5 г/л холево- кислого натрия и не менее 10 ед/л холесте- ринэстеразы, инкубируют не менее 2 мин при 25-55°С,после чего аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету, содержащую не менее 0,01 м/л при рН 8,0-8,6, не менее 0,003 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,1 г/л п-йодфенола и не менее 0,1 г/л люминола, с последующей регистрацией скорости образования пероксида водорода хемилюминесцентным методом.

Предложенный способ отличается от известного порядком проведения операций, а именно, разделением стадии гидролиза и экстракции со стадией окисления, что дает возможность осуществлять гидролиз в оптимальных условиях при температуре 25- 55°С не менее 2 мин, соотношением реагентов в гидролизующей и окисляющей смесях, а также тем, что регистрация скорости образования пероксида водорода осуществляется хемилюминесцентным методом.

Указанные отличительные признаки позволяют повысить чувствительность определения.

Пример 1. К 0,02 мл сыворотки крови добавили 1,8 мл гидролизующей смеси (смесь 1 : 0,1 М трис-НС., 15,0 г/л холево- кислого натрия, 0,05 ед/мл холестеринэсте- разы, рН 7,2). После перемешивания инкубировали 20 минут. Затем из полученного раствора отбирали 0,1 мл и добавляли в измерительную кювету люминометра LKB 1250, доводили до объема 1,0 мл смесью 2 (смесь 2: буфер 0,1 М трис-HCI, рН 8,2, содержащий 3,0 г/л холевокислого натрия, 0,5 ед пероксидазы, 0,05 ед холестериноксидазы, 0,1 г/л п-иодфенола, 0,1 г/л люминола). Перемешивали и через одну минуту фиксировали интенсивность люминесценции.

Пример 2. Условия измерений те же, что и в примере 1, за исключением того, что изменяли концентрацию пероксидазы. данные, приведенные в таблице 2, получены

для стандартной сыворотки с концентрацией холестерина 6,1 мкМ.

Из данных, приведенных в табл. 2, сле- 5 дует, что оптимальными концентрациями пероксидазы.при анализе являются концентрации не менее 0,003 ед/л.

Пример 3. Условия измерения те же, что и в примере 1, за исключением того, что 10 изменяли концентрацию холестериноксидазы. Результаты измерений приведены в таблице 3 для стандартной сыворотки с концентрацией 6,1 мкМ.

Из данных, приведенных в табл. 3, сле- 15 дует, что оптимальными являются концентрации холестериноксидазы не менее 0,5 ед/л.

Пример 4. Условия измерений те же, что в примере 1, за исключением того, что 20 изменяютконцентрацию п-йодфенола. Данные приведены в табл. 4.

Из данных, приведенных в табл. 4, следует, что оптимальной концентрацией п- йод фенола является концентрация не менее 5 0,1 г/л.

Пример 5. Условия измерения те же, что в примере Т, за исключением того, что изменяют концентрацию люминола. Данные представлены в табл. 5. 30 Из данных, приведенных в табл. 5, следует, что оптимальной концентрацией люминола является концентрация не менее 0,1 г/л.

Пример 6. Условия проведения зкс5 перимента аналогичны таковым в примере

1, за исключением того, что при анализе

стандартной сыворотки (5 мМ) используют

различные значения рН при проведении

первой стадии реакции гидролиза. Резуль0 тэты измерений приведены в табл. 6.

Из полученных данных следует, что оптимальные значения рН для проведения реакции гидролиза составляют 6,5-8,0.

Пример 7. Условия эксперимента 5 аналогичны условиям в примере 1, за исключением того, что используют различные кон- центрации холевокислого натрия в гидролизующей смеси. Результаты измерений приведены в табл. 7.

0 На основании данных, приведенных в табл. 3, оптимальная концентрация холевокислого натрия в гидролизующей смеси составляет 5-20 г/л.

Пример 8. Условия проведения экс- 5 перимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что изменяют температуру, при которой проводится гидролиз (табл. 8).

Из данных, приведенных в табл. 8 следует, что полный гидролиз этерифицирован- ного холестерина достигается при

температуре 25-55LlC при концентрации хо- лестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующей смеси 2 г/л (активность холестеринэстеразы 30 ед/л).

Пример 9. Условия эксперимента те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию холестеринэстеразы в смеси. Данные представлены в табл.9,

На основании данных, приведенных в табл. 9, оптимальная концентрация холестеринэстеразы составляет не менее 10 ед/л при температуре и времени гидролиза 10мин.

Формула изобретения

Способ определения холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстрат пероксидазы, соль желчных кислот, холесте- ринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую регистрацию скорости образования перекиси водорода, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5-8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л, холестеринэ- стеразу не менее 10 ед/л, инкубируют не менее 2 мин при 25-55°С, затем аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету, содержащую буфер с рН 8,0-8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 1 г/л, пероксидазу не менее 3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0,5 ед/л, п-иодфенол в концентрации не менее 0,1 г/л и люминол в концентрации не менее 0,1 г/л, а регистрацию проводят путем измерения хемилю- минесценции.

Использование: медицина, ферментативный анализ. Цель изобретения - повышение точности способа. Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55°С в течение 2-20 мин реагентом, содержащим холесте- ринэстеразу, буферную смесь и детергент, при этом происходит гидролиз этерифици- рованного холестерина. На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования пероксида водорода. Регистрацию ведут хемилюминесцент- ным методом. 9 табл.

Концентрация пероксидазы, ед/л

0,001

0,003

0,01

1,00

10,0

25

Т а б л и ц а 1

Таблица2

Измеренная концентрация холестерина в станд. сыворотке, мкМ

1,2 + 0,70 6.0 + 0,35 5,9 + 0,27 6,1 +0,23 5,95 + 0.33

Концентрация холестериноксидазы, ед/л

0,005

0,05

0,5

5,0

10,0

20,0

Концентрация люминола, г/л

0,01

0,05

0,10

0,25

0,50

рН при проведении гидролиза

6,0 6,5 7,0 7.5 8,0 8,5 9,0

ТаблицаЗ

Измеренная концентрация холестерина в станд. сыворотке , мкМ (п+ 5)

0,7 + 2,8

1,9 + 1,5

5,86 + 0,43

6,1 +0,24

Та блица4

Таблица5

Измеренная величина концентрации холестерина в станд. сыворотке, мкМ

1,7 + 1,31 5,4 + 0,86 6,1 +0,15 6,0 + 0,28 5,9 + 0,31

Таблица 6

Измеренная величина станд. сыворотки, мМ

2,65 + 0,38 4,8 + 0,25 4,75 + 0,27 5,0 + 0,245 4,9 + 0,235 4,25 + 0,29 2,5 + 0,57

Концентрация холевокислого натрия, г/л

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

15,0

20,0

25,0

Температура гидролиза

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Активность холестеринэстеразы, ед/л

3,0

7,5

10,2

15,0

22,

30,0

45,0

60,0

75,0

Таблица

Измеренная величина концентрации холестерина в станд. сыворотке, мМ ()

0,6 + 2,01 2,5 + 0,72 4,8 + 0,34

4,85 + 0,25

5,0 + 0,216 4,9 + 0,26

4,85 + 0,18 4,9 + 0,22

4,25 + 0,062

ТаблицаЗ

Измеренная величина концентрации холестерина в станд. сыворотке , мМ, ()

4,50 + 0,3

4,85 + 0,88

4,95 + 0,19

5,0+0,17

4,9 + 0,16

4,85 + 0,22

5,0 + 0,22

4,85 + 0,17

4,9 + 0,25

4,0 + 0,43

ТаблицаЭ

Измеренная величина концентрации холестерина в станд. сыворотке, мМ ()

1,5+ 1,20

4,4 + 0,28

4,75 + 0,26

4,95 + 0,20

5.0 + 0,22 4,9 + 0,25 4,85 + 0,41 4,95 + 0,34