Реактив для ферментативного определения холестерина Советский патент 1978 года по МПК G01N33/16 

(54). РЕАКТИВ ДЛЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА холевая, таурохолевая и дезоксихолевай, а также соли кислот жирного ряда и саркозиды жирных кислот, Используют ,и производные серной кислоты, которые обладают дополнительным свойством стабилизировать известные остаточные продукты окисления некоторых индикаторов (о-тоЛйдин, гетероциклический азкн) например сложный эфир сульфоянтарной кислс ты алкклариловыё сульфонаты, алкиловые сульфонаты, алкклполиоксиэтиленсульфаты. Из катионных смачивателей пригодными являются соли алкилпиридина или триметиламмония, а также соединение хлорид бензотония. Из амфотерных смачивателей применяют, напргмер, имйдазолбетаин, а также натрий-ди- (2-этилгекспл) -сульфосукцинат, додецилсульфат натрия, блеат натрия, хлористый бензал-, коний и хлористый цетилпиридиний. Ионнаё или амфотер ые. смачиватели применяют в когйбйиации с неионными. Неионные смачиватели, .содержащие минимум одну группу он, обладают примерно в 5- 10 раз большей активностью и позволяют получить соответствующее увеличение скорости течения реакции или сокращение ее длительности по сравиению с другими поверхностноактивными веществами. Они эффективны и в малых количествах. ,. : Количество доба ляёмых поверхностно-активных веществ зайи..сит от их молекулярного веса и степени гидрбфобности и гидрофидьности. Слишком малое количество не дает нужного эффекта активации, а слищком большое - ведет к денатурированию фермента. Оптимальные концентрации для каждого пригодного .поверхностно-активного вещества определяют экспериментально. Например, для гидроксиполиэтокскдодёкана они составляют ОЛ5-0,6. вес. %, аддуктов окиси октилфенолэтйлена от 0,03 до 0,1 вес. %, для производных полиоксиэтклена сорбитангидридов от 0,15 до 0,6 вес. %, для дезоксихолата наТрвя от 0,03 до 0,05 вес. %, для аддуктов окиси алкилфенолэтилена меркаптанового ряда (например, стерокс SE) от 0,005 до. 0,02 вес. %. Реактив для определения холестерина представляет собой раствор, содержащий холестерииоксидазу, систему для определемия перекиси водорода, буферные раствор и поверхности i-aKTi sBHOe вещество, которым пропитывают .носитель, синтетическую пленку или их оболрчку. Поверхиостно-активное вещество срдержнтсп в концентрации от 2 до 30%, npefiMyщественио SO-20%, «по отношению к твердым реактивам. Предпочтительной системой для выявления перекиси водорода является система, .состоящая из пероксидазы, окислительного надикатора, агента набухании или ста.билизатора. ;.: Чтобы приготовить реактив для выявления хойестёрина в сыворотке крови, используют обычную бумагу для тестов, которую гидрофо|5ирук)Т или покрывают полупроводйщей мем браной из сложных эфиров целлюлозы или йсйользуют пленки для тестов. Для изготовления последних чолестериноксида у, пероксиfliiaV. буферный раствор, индикатор, агенты абухания вместе с поверхностно-активными еществами смещивают в водную дисперсию ленко.образующего полимера.-Эту дисперсию амазывают тонким слоем .на-бумагу и высуивают. Если содержащую холестерин кровь акапать на такой слой реактива и стереть ее римерно через одн минуту, то реактив окращивается, и глубина окраски зависит от количества холестерина. .ч Реактив пригоден также для выявления и определения содержаний свободного холестерина. Если же имеются сложные холестериновые эфиры; то из них сначала нужно высвободить холестерин. Это осуществляют путем рмылеиия йодным раствором щелочи. Пригодной системой для выявления образовавщейся при окислении холестерин;а пере-. киси водорода является система, содержащая пероксидазу, буферный раствор, окислительные индикаторы. Из пероксидаз предпочтительны пероксидаза хрена, а также лектопероксидаза. В качестве буферных растворов применяют распространенные фосфатные, цитратные или боратные с рН от 4 до 9, преимущественно ОТ 5 до 8. Окислительными индикаторами служат производные бензидина, например, о-толидин, о-ваиилин. К реагентам можно добавлять распростраиенные агеиты набухания - алгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу, а также стабилизаторы для ферментов, например дитиэритрий. Пример 1. 0,05 л сыворотки крови вводят в 10 мл 0,5 н.буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,4 вес. % гидроксиполнэтоксидодекана. Экстинкцию (i) считывают при 240 нм в соответствующем спектральном фотометре, а реакция начинается с добавления 0,02 мл (0,Ш) стабильной при хранении, освобожденной от следов смачивателя хо.лестериноксидазыв 1 М растворе сульфата аммония. Через 3 мин экстинкцию (Еу) считывают снова. Кондентрацию образовавщегося свободного холестерина и общего холестерина определяют из разницы между первым и вторым считыванием с учётом молекулярного коэффициента экстинкции для холестерина при 240 нм (1Е,5 см /моль). Измерение типичной пробы Дает 62 мг % свободиого холестерциа и 67 мг /о общего холестерина (после омыления). При сравнительном аИализе без добавления поверхностно-активного вещества продол}{{ительность реакции составляет 15 мин. Удаление следов смачивателя для улучшения стабильности хранения фермента осуществляют при помощи гидрофобных адсорбирующих смол. Пример 2. 0,05 мл сыворотки крови вводят в JO мл 0,5 н.буфериого раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 вес. % гидроксийолиэтоксидрдекана и 0,03 вес. % дезо.ксихолата натрия. Экстинкция (fi) считывается при 240 нм на спектральном фотометре, и реакция начинается с добавления 0,02 мл (О,Ш) стабильной при хранении, освобождённой от следов с;чачивателя холестериноксидазы в 1 М растворе сульфата аммония. Через 3 мин ЭКСТИНКЦИЮ (Ез) снова считывают. Концентрацию образовавшегося свободного холестерина и общего холестерина определяют аналогично примеру I. Измерение типичной пробы дает 65 мг % свободного холестерина и 170 мг /о общего холестерина (после омыления). Пример 3. 0,05 мл сыворотки крови вводят в 10 мл 0,5 н.буферного раствора фосфата калия (рН 7,5.), содержащего 0,2 вес. °/о гидроксипоЛиэтоксидодекана и 0,1 вес. % вторичного сульфата алкила. Экстинкция (Ei) считывается при 240 им в спектральном фотометре, и реакция начинается с добавления 0,02 мл (0,1U) стабильной при хранении, освобожденной от следов смачивателя хоЛестериноксидазы в I М растворе сульфата аммония. Через 3 мцн экстинкцию (2) снова считывают. Концентрацию образовавшегося свободного холестерина и общего холестерина определяют аналогично примеру 1. Измерение типичной пробы дает 62 мг °/о свободного холестерина и 167 мг /о общего холестерина (после омыления). Пример 4. Фильтровальную бумагу пропитывают раствором следующего состава, мг/ /100 мл дистиллированной воды: Цитратный буферный раствор (1М, рН 5,25) 20 Холестериноксидаза100 Первксидаза50 Эту бумагу высушивают при 40°С и им прегнируют растворами по 0,2 г о-толндина в 100 мл хлористого метилена, каждый из которых, кроме того, содержит lio 1 г следуюtuHx поверхностно-активных веществ: полиоксиэтилеитрибутилфеноловь1Й эфир, лолиоКсиэтнленсорбитанмонолаурат, полиоксизтиленнонилфеноловый эфир, полиоксиэтнленлауриэовый эфир, подирксиэтиленцетиловый эфир, нолноксиэтиЛенстеарат, полиоксиэтилендодецилтио. эфир. После сущки получают бумагу для тестов, которая окрашивается холёстерннсодержащйми сыворотками в зеленый цвет. Когда сыворотки одновременно содержат сложный хо. лестериновый эфир, то получают более, резкую зеленую окраску, если сыворотку до это го предварительно разбавляют одной канлеЙ pacTBOpia холестеринэстеразы. Бумага для тестон, не содержащая поверхностно-активных, веществ, не реагирует с указанными сыворотками.. Пример 5. Фильтровальную бумагу пропитывают раствором следующего состава, г/100 мл дисФиллированной воды:. Цитратны буферный раствор (1 н., рН 7)20 (мл) Холестернноксидаза0,10 Холестеринэстераза0,25 Пероксидаза .. 0,05 Эту бумагу высушивают при 40°С и импрегнируют растворами по 0,2 г.о-толидина в 100 мл хлористого метилена, которые. Кроме того, содержат каждый по 0,5 г следующих поверхностно-активных йеществ: полиоксиэтиленкокоат. полирксиэтиленолеат, полиоксиэтиленполнпропиленгликол-ь, полиоксиэтиленстеарнламнн, полиоксиэтиленглицеринмонолаурат. Послесушки получают реактив для тестов, который, реагируя с сыворотками крови, окрашивается в зеленый цвет, если они содержат холестерин или сложный холестериновый эфир. Бумага для тестов без поверхностно-активных веществ не дает реакции на указанные сыворогки. Пример 6. Предварительно импрегннрованную бумагу по примеру 4 дополн 1тельно импрегнируют растворами.по 0,3 г о-толидина в 100 мл ацетона, содержащи № по 1,5 с следующих поверхностно-активных веществ; дноктилеульфосукцинат нртрия, натриевая соль додецилбензолсульфоновой кислоты, натриевая соль лаурилполигликольэфирсульфата, лаурнл саркозинат натрия, лаурат натрия, холевая кислота, дезоксихолевая кислота, таурохолат натрия. Этот реактив обладает такими же свойствами, как и реактив ло примеру 4, но он доль ше сохраняет стабильность красок реакции. - Пример 7. Предварительно импрегннровг|нную бумагу по примеру 5 дополнительно нмпрегнируют растворами, содержащими по 0,4 г о-толидина н по 0,5 г следующих поверхностно-активных веществ: хлористый лаурилпнридйн, хлористый бензетоний, хлористый цетилтриметиламмоннй, 1 -гидроксиэтйл-1 -карбоксим°тил-2-алкнл-имндазолинийбетакн. Свойст ва этого реактива аналогична свойствам реактива по примеру 5. Пример 8. Фильтровальную бумагу пропитывают раствором следующего состава, г/500 мл дистиллированной воды: Фосфатный буферный раствор (1 и,, рН 6)25 (мл) ХолестериноксидазаО, О Пероксндаза0,05 Холевая кислотаJ,00 Ацетон 0 (мл) Эту бумагу высушивают при 40°С к дополнительно пропитывают растворами окис чнельных индикаторов в 100 мл ацетона. Колиество индикаторов, ИХ химическая структура нх реакцая окраски с содержащими холетериИ сыворотками приведены з таблице Йример 9. При1отавливают смесь на слеующих компокертов г/50 мл воды: Дисперсия поливинилпропишгатаАлгинат натрия (1,.в 0,5 молях фосфатного буферного раствора, Холестеринокскдаза Пероксидаза Диоктилсульфосукцинат натрия о-Толидин .(растворенный в 6 млацетона)0,60 Эту смесь растягивают в пленку тр.пияой 300 мм по мокрому или намазывйют на вердый носитель и высушивают при . Еси на пленку накапать кровь, содержащую олестерин, и стереуь ее через несколько минут, то пленка окрасится в зеленый цвет различной глубины в зависимости от концентрации холестерина. Если затем к этому препарату добавить еще 1,0 г холестеринэкстеразы, то получится пленка, при помощи которой можно определить повышенное содержание сложкых холестериновых эфиров. Предлагаемый реактив для формеитатинного определения холестерина позволяет быстро проводить анализы.

о В нвллилиден-п «ваниллоилгнпразон

Аэино био-(Я -этвлбвнзотиааолон- сулЬфокислота«5)-диаммониевая соль

Aaianoie Ho-(N -вл1шлжиноло -2- суяьфоЕнслота -6)-йиамМ ониевая соль

Бж(Н- алкилхинолон 2)-аэин

{N - м®тш енаотиааоло№ 2)Н -©тагеФормула изобретения

Реактив для ферментативного определения холестерина, содержащий холестериноксидазу, поверхностно-активное вещество и солевой буферный раствор, отличающийся тем, что, с целью ускорения анализа, он содержит указанные компоненты в, следующих количествах: вес. %:

Фиолетовый Зетюный

Фнолетово-синий Фнэлетовый

Холестериноксидаза Поверхностно-активное вещество, преимущественно гидроксинолиэтоксидекан

Солевой буферный раствор, преимущественно 0.5 н.фосфорнокислый калий