СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-БЕТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК C12P21/00 C12P21/02 C12N15/28 

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ выделения и очистки физиологически активного рекомбинантного фактора некроза опухолей бета человека (рчФНО-бета), пригодного для научно-исследовательских работ и в качестве медицинского препарата.

Рекомбинантный ФНО-бета человека представляет собой негликозилированный полипептид с молекулярной массой около 17 кД, идентичный природному полипептиду ФНО-бета человека с 22-й по 177-ю аминокислоту, метионилированный с N-конца. Рекомбинантный ФНО-бета сохраняет свойства природного, вызывает некроз некоторых видов опухолей [1, 2] и является иммуномодулятором широкого спектра действия. ФНО-бета обладает выраженным противовирусным действием [3] , описаны его радиопротекторные свойства [4]. Все это делает перспективным его применение в медицине. Однако использование рекомбинантных белков в медицине предъявляет повышенные требования к чистоте препаратов, в частности к содержанию примесей чужеродных белков, ДНК и липополисахаридов (ЛПС). Чистота препарата рекомбинантного белка должна быть не менее 95% (электрофоретически гомогенен), содержание примесей чужеродных белков не более 200 нг/мг, примесей ДНК не более 100 пг/мг [5], ЛПС не более 200 нг/мг белка [6, 7].

Известны способы получения ФНО-бета (он же лимфотоксин) микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных ДНК [8-11]. Способ [8] основан на очистке рекомбинантного ФНО-бета с использованием хроматографии на колонке с моноклональными антителами. Данные о выходе и чистоте целевого продукта отсутствуют. Недостатки способа: сложность и высокая стоимость получения иммунного сорбента, трудность масштабирования процесса, необходимость дополнительного контроля целевого продукта на отсутствие онкогенного материала родительской миеломной клетки, используемой при получении моноклональных антител.

Способ [9] основан на использовании штамма E.coli HB 101, трансформированного плазмидой pCG 402, содержащей ген ФНО-бета под контролем триптофанового промотора. Клетки выращивают на глюкозосолевой среде с добавлением казаминовых кислот, тиамина, триптофана и ампициллина. Для экспрессии гена ФНО-бета проводят индукцию индолакриловой кислотой. Полученные клетки разрушают ультразвуком и клеточный экстракт хроматографируют на ДЕАЕ-сефарозе CL-6B. Для удаления примесей бактериального эндотоксина (ЛПС) используют колонку с детоксигелем. Выход рекомбинантного ФНО-бета составляет 8 мг из 1 л клеточной культуры, специфическая активность препарата 3-5•10⁷ ед/мг. Недостатки способа: использование на стадии выращивания продуцента дефицитных добавок (тиамин, триптофан) использование индуктора для экспрессии целевого гена; быстрый и эффективный процесс очистки ФНО-бета возможен лишь при высоком содержании его в общей массе внутриклеточных белков. В способе используют клетки с содержанием целевого продукта до 34% от общей массы клеточных белков, однако в растворимой форме находится лишь 10-12% ФНО-бета.

Способ [10] основан на использовании штамма E.coli M154, трансформированного плазмидой pDS 78/RBS11, кодирующей ФНО-бета под контролем лактозного оперона. Клетки выращивают стандартным способом. Для экспрессии гена ФНО-бета проводят индукцию лактозного оперона изопропил-1-тио- β -D-галактопиранозидом. Полученные клетки (60 г с 10 л среды) суспендируют в 50 мМ трис-HCl буфере pH 8,5, содержащем 10% глицерин, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ бензамидинхлорид, 1 мМ ортофенантролил, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 1 мМ ЭДТА, 2,8 мг ДНКазы и 100 ед/мл трасилола, и разрушают ультразвуком. Нерастворимый материал удаляют центрифугированием, клеточный экстракт диализуют и хроматографируют на ДЕАЕсефарозе. Далее целевой продукт очищают хроматографией на S-сефарозе и фракционированием сульфатом аммония. Выход электрофоретически гомогенного ФНО-бета составляет 10 мг из 10 л клеточной культуры (0,17 мг из 1 г биомассы). Специфическая цитолитическая активность препарата сравнимая с цитолитической активностью стандартного препарата ФНО-альфа (абсолютное значение не приведено). Содержание примесей чужеродных белков, ДНК, ЛПС не приведено.

Недостатки способа:
- использование штамма E.coli M15, требующего индукции лактозного оперона изопропил-1-тио- β-D-галактопиранозидом и содержащего протеазы различных типов, способные инактивировать ФНО-бета в процессе очистки и, как следствие этого, использование для защиты от протеолиза набора ингибиторов протеаз: бензамидинхлорида, ортофенантролина, фенилметилсульфонилфторида и трисилола;
- использование недостаточно эффективных процедур очистки, что приводит к низкому выходу препарата.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения полипептида со свойствами лимфотоксина человека [11, прототип], который основан на использовании штамма E. coli SG-20050 (ВКПМ В-5279) Докл. от 25.11.98, трансформированного плазмидой pLT21, кодирующей ФНО-бета под контролем двух промоторов ранней области бактериофага T7, обеспечивающих конститутивный синтез целевого белка. Клетки выращивают стандартным способом в L-бульоне и собирают центрифугированием. Полученные клетки суспендируют в 10 мМ трис HCl, pH 8,7-9,2, 1 мМ ЭДТА (буфер "А") в соотношении 4-5 мл буфера на 1 г клеток, добавляют фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) до 0,1 мМ и суспензию обрабатывают ультразвуком. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием. Супернатант очищают хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе (40 мл сорбента на 10 г клеток). Элюцию проводят линейным градиентом концентрации хлористого натрия в буфере "А". Фракции анализируют на содержание рчФНО-бета гельэлектрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле по Лаемли [12]. Фракции, содержащие рчФНО-бета, собирают, разбавляют в 1,5 раза буфером "Б" (10 мМ HEPES, pH 6,6-6,8) и наносят на колонку с гидроксилапатитом (25 мл сорбента на 10 г клеток). Элюцию проводят линейным градиентом концентрации хлористого натрия в буфере "Б".

Выход электрофоретически гомогенного препарата рчФНО-бета оставляет 20-35% от содержащегося в исходном экстракте. Специфическая активность препарата не менее 3•10⁷ ед/мг белка (по цитолитическому действию на клетки мышиных фибробластов L929 в присутствии актиномицина D).

Недостатком способа-прототипа является то, что получаемые по этому способу препараты рчФНО-бета содержат значительное количество примесей ДНК (более 200 пг/мг белка) и ЛПС (более 10 мкг/мг белка), и в связи с этим они не удовлетворяют требованиям Фармкомитета, предъявляемым к медицинским препаратам, получаемым генно-инженерным способом [5], и не могут быть использованы в медицине.

Технической задачей предполагаемого изобретения является получение препарата рчФНО-бета с низким содержанием нежелательных примесей ДНК и ЛПС и пригодного для использования в медицине.

Поставленная цель достигается введением в способ-прототип дополнительной стадии хроматографической очистки рчФНО-бета на гидроксилапатите в градиенте концентрации калия фосфорнокислого однозамещенного от 10 до 300 мМ при pH 7,0-7,2, введение которой позволяет в конечном итоге уменьшить содержание ДНК в препаратах рчФНО-бета в 10 раз и ЛПС в 100 раз по сравнению с препаратами, получаемыми по способу-прототипу.

Сущность способа заключается в следующем: биомассу E.coli SG-20050/pLT21, выращенную стандартным способом в L-бульоне и собранную центрифугированием, суспендируют в буфере, разрушают ультразвуком и грубый экстракт клеток подвергают хроматографии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозной ДЕ-52, как описано в способе-прототипе. Элюированный с колонки раствор рчФНО-бета разбавляют в 2 раза буфером "Б" (10 мМ калий фосфат, pH 7,0-7,2), подтитровывают раствор до значения pH 7,0 и наносят на колонку с гидроксилапатитом (10 мл сорбента на 10 г клеток). Колонку промывают буфером "Б" и элюируют белки линейным градиентом концентрации калия фосфорнокислого однозамещенного от 0,01 до 0,3 М. Фракции рчФНО-бета, элюированные при концентрации KH₂PO₄ 0,15-0,2 M, диализуют против буфера "В" (10 мМ HEРES, pH 6,6) и наносят на вторую колонку с гидроксилапатитом (5-7 мл сорбента на 10 г клеток), колонку промывают буфером "В" и элюируют белки линейным градиентом концентрации хлористого натрия в буфере "В". Препарат рчФНО-бета, элюированный с колонки при концентрации NaCl 0,15-0,2 М, имеет электрофоретическую чистоту более 95%.

Выход электрофоретически гомогенного рчФНО-бета составляет 15-25% от содержащего в грубом экстракте. Специфическая активность полученного препарата составляет 3•10⁷ ед/мг белка (по цитолитическому действию на клетках мышиных фибробластов L929 в присутствии актиномицина D).

Содержание примесей ДНК в полученном препарате составляет 30-100 пг/мг белка, что в 6-10 раз меньше, чем в препаратах, получаемых по способу-прототипу (640 пг/мг белка), примесей ЛПС - 150-200 нг/мг белка, что в 40 - 100 раз меньше, чем в препаратах, получаемых по способу-прототипу (8000-15000 нг/мг белка).

Новым по сравнению со способом-прототипом является использование дополнительной хроматографической стадии очистки рчФНО-бета на гидроксилапатите в градиенте концентрации калий фосфата при значениях pH 7,0-7,2. В этих условиях ЛПС на колонке не сорбируются, а примеси ДНК фракционируются следующим образом: низкомолекулярные не сорбируются, а высокомолекулярные сорбируются, но элюируются при более высокой концентрации калий фосфата (> 0,2 М), чем рчФНО-бета (фиг.1). Таким образом, введение этой стадии позволяет элюировать очищенный рчФНО-бета при концентрации соли 0,15-0,20 М с высоким выходом и наиболее эффективно очистить целевой белок от нежелательных примесей ДНК и ЛПС.

Предполагаемое изобретение иллюстирируется фигурами графического изображения, где представлены:
Фиг. 1. Профиль элюции рчФНО-бета на гидроксилапатите в градиенте концентрации калия фосфорнокислого однозамещенного, pH 7,0.

Фиг.2. Электрофоретический анализ белков в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS в процессе очистки рчФНО-бета
дорожки: 1 - клеточный экстракт
2 - целевая фракция с ДЕАЕ-целлюлозы
3 - целевая фракция с гидроксилапатита (градиент концентрации калий фосфата)
4 - целевая фракция с гидроксилапатита (градиент концентрации натрия хлористого) - 10 мкг
5 - то же 40 мкг
Примеры конкретного выполнения способа приведены ниже.

Пример 1. Выделение рчФНО-бета по заявленному способу.

100 г клеток E.coli SG-20050/pLT21 суспендируют до гомогенного состояния в 400 мл буфера А (10 мМ трис-HCl, pH 8,8) с добавлением фенилметилсульфонилфлуорида до 0,1 мМ. Затем суспензию обрабатывают ультразвуком. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием. Супернатант наносят на колонку (6,0 х 50 см; V= 500 мл) с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ52, проводят хроматографию и анализируют рчФНО-бета, как в способе-прототипе. РчФНО-бета обычно элюируется с колонки при концентрации NaCl 0,07-0,12 М. Фракции, содержащие рчФНО-бета, объединяют (V = 150 - 200 мл), разбавляют в 2 раза буфером Б (10 мМ KH₂PO₄, pH 7,0), доводят до pH 7,0 разбавленным раствором соляной кислоты под контролем pH-метра и наносят на колонку со 100 мл гидроксилапатита, уравновешенного буфером Б. После нанесения белкового раствора колонку промывают буфером Б до снижения оптической плотности раствора при длине волны 280 нм до оптической плотности буфера Б и белки элюируют линейным градиентом концентрации калия фосфорнокислого однозамещенного от 0,01 до 0,3 М при pH 7,0 (V_{градиента}=500 мл). РчФНО-бета элюируется обычно при концентрации 0,15-0,2 М. Фракции, содержащие рчФНО-бета, объединяют и диализуют против буфера В (20 мМ HEPES, pH 6,6) в течение 20 ч и заносят на колонку с 50-70 мл гидроксилапатита, уравновешенного буфером В. Хроматографируют, как в способе-прототипе (V_{градиента}= 200 мл). РчФНО-бета обычно элюируется при концентрации NaCl 0,15-0,2 М. Фракции, содержащие рчФНО-бета, объединяют и диализуют против буфера Г (10 мМ NaH₂PO₄, pH 7,2; 0,15 M NaCl). Конечный объем полученного препарата 73 мл, концентрация белка 1,4 мг/мл, активность 3 • 10⁷ ед/мг, электрофоретическая чистота более 95% (фиг.2, дор. 4, 5), содержание примесей ДНК - 32 пг/мг белка, ЛПС - 200 нг/мг белка. Данные по очистке рчФНО-бета из биомасс с различной продуктивностью приведены в табл. 1 и 2.

Из данных табл. 1 и 2 видно, что заявляемый способ очистки позволяет получать с высоким выходом электрофоретически гомогенные препараты рчФНО-бета, свободные от примесей чужеродных белков, ДНК и ЛПС из биомасс с практически любым содержанием целевого продукта.

Пример 2. Хроматографическая очистка рчФНО-бета из экстракта клеток на гидроксилапатите в градиенте концентрации калий фосфата при различных значениях pH.

Очистку препарата проводят, как в примере 1, но элюцию белков на гидроксилапатите в градиенте концентрации калий фосфата проводят при значениях pH от 6,4 до 7,4. Результаты очистки по этой стадии представлены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что при хроматографии рчФНО-бета на гидроксилапатите в градиента концентрации калий фосфата при pH выше 7,2 и ниже 7,0 увеличивается доля целевого белка, не сорбировавшегося на колонку, и снижается его количество в целевой фракции и фактор очистки с 2 до 1,7 при pH 6,8 и до 1,2 при pH 7,4.

Пример 3. Использование для дополнительной очистки рчФНО-бета 2-й хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе.

Очистку препарата рчФНО-бета из 100 г клеток, включая хроматографию на первой ДЕАЕ-целлюлозной колонке и гидроксилапатите, проводят, как описано в способе-прототипе. Фракции, содержащие рчФНО-бета, объединяют, диализуют против буфера А и наносят на колонку с 200 мл ДЕАЕ-целлюлозы, уравновешенной буфером A. Колонку промывают буфером А до отсутствия оптической плотности при длине волны 280 нм и белки элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,3 М в буфере А (V_{градиента} = 1 л). Фракции, содержащие рчФНО-бета, объединяют и диализуют против буфера Г (10 мМ калий фосфат, pH 7,2, содержащий 0,15 М натрия хлористого). Конечный объем препарата 80 мл. Концентрация белка 1 мг/мл, цитолитическая активность 3•10⁷ ед/мг, электрофоретическая чистота >95%, содержание примесей чужеродных белков 200 нг/мг белка, ДНК - 160 пг/мг белка, ЛПС - 12600 нг/мг белка. Данные по выделению и очистке рчФНО-бета способом-прототипом, дополненным 2-й хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, приведены в табл. 4.

Из данных табл. 4 видно, что способ-прототип позволяет получить препарат рчФНО-бета с высоким выходом (18-21%) и с чистотой более 95% (электрофоретически гомогенен), однако содержание нежелательных примесей ДНК и ЛПС высоко и не удовлетворяет требованиям, предъявляемым для медицинских препаратов. Введение дополнительной стадии очистки на ДЕАЕ-целлюлозе не приводит к получению препарата рчФНО-бета необходимой чистоты.

Таким образом, использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет без уменьшения выхода целевого продукта получать препараты рчФНО-бета, свободные от существенных примесей ДНК и ЛПС и пригодные для получения лекарственных препаратов. Эти преимущества достигнуты использованием для очистки рчФНО-бета дополнительной хроматографии на гидроксилапатите в градиенте концентрации калия фосфорнокислого однозамещенного при pH 7,0-7,2 без увеличения общего объема используемого в процессе гидроксилапатита.

Литература
1. Fiers W. , Brouckaert P., Devos R //Cold Spring Harbor Simp. Quant. Biol. 1986. V. 51. P. 587-596.

2. Miyeke M., Fachimoto S., Ovita K. //Exp. Cell Biol. 1988. V. 56. P. 297-302.

3. Mestan J., Digel W., Mittnacht S. et al. //Nature. 1986. V. 323. P. 816-819.

4. Wong G.H. //Biochem. Biophys. Acta. 1995. V. 1271, N 1. P. 205-209.

5. РД 42-28-9-89. Общие требования к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методами генной инженерии. Москва. 1988.

6. Roth R.I., Levin J. //Meth. Enzymology. 1994. V. 231. P. 75-91.

7. Tanaka S., Jwanaga S. //Meth. Enzymology. 1993. V. 223. P. 358-365.

8. Gray P.W., Aggarwal B.D., Benton C.V. et al. //Nature. 1984. V. 312, N 5996. P. 721-724.

9. Seow H.-F., R.Goh C.R. Krishnan L. et al. //Biotechnology.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано для получения фактора некроза опухолей-бета (ФНО-бета). Способ выделения и очистки рекомбинантного ФНО-бета включает культивирование штамма-продуцента E.coli SG20050/pLT 21, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса, хроматографическую очистку на колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и гидроксилапатитом и дополнительную стадию очистки продукта на гидроксилапатите в градиенте концентрации калия фосфорнокислого однозамещенного при значениях pH 7,0 - 7,2. Способ позволяет получить препарат рекомбинантного ФНО-бета человека, свободный от примесей чужеродных белков, ДНК и ЛПС и пригодный для медицинских целей. 2 ил., 4 табл.

Способ получения рекомбинантного фактора некроза опухолей-бета человека, включающий культивирование штамма-продуцента E.сoli SG 620050/-pL T21(ВКПМ-5279), разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса и хроматографическую очистку на колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и гидроксилапатитом, отличающийся тем, что проводят дополнительную очистку продукта на гидроксилапатите в градиенте концентрации калия фосфорнокислого однозамещенного при значениях pH 7,0 - 7,2.