СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ HINF I Российский патент 1999 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биохимии и микробиологии, в частности к выделению и очистке эндонуклеаз рестрикции, синтезируемых микроорганизмами рода Haemophilus, а именно к получению эндонуклеаз рестрикции Hinf I, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GANTC-3'.

Сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) стали в настоящее время незаменимым инструментом для исследования структуры ДНК, создания рекомбинантных молекул, изучения генетического материала. В связи с этим актуальной задачей является создание методических подходов к разработке высокоэффективной технологии получения ферментов этого типа.

В каждом конкретном случае эта задача решается эмпирически путем подбора способов и условий очистки ферментов в ходе предварительных опытов. Наиболее известными способами очистки эндонеуклеаз рестрикции являются способы, приведенные в конце описания в таблице.

Известен способ выделения эндонуклеазы рестрикции Hinf I [4], который включает незначительное количество стадий выделения, однако он рассчитан на получение небольших образцов фермента. Он не технологичен и не может быть использован при масштабировании процесса в виде сложности осуществления контроля за температурой в процессе разрушения и термообработке биомассы, что требует дополнительного материального оснащения.

Известен способ выделения эндонуклеазы рестрикции из значительно большего количества биомассы клеток Haemophilus influenzae [3, прототип], который включает следующие стадии: разрушение клеток ультразвуком (получение грубого экстракта), центрифугирование и освобождение от дебриса, очистку на гидроксиапатите, сульфат-аммонийное осаждение, диализ, очистку на Sephadex G-25, хроматографию на P-11 фосфоцеллюлозе, концентрирование на липогеле.

Недостатком данного способа является многостадийность процесса. Кроме того, способ приводит к большим потерям и дает возможность получить около 8% общей активности фермента, грубый экстракт содержит большое количество неспецифических нуклеаз.

Технической задачей изобретения является усовершенствование процесса выделения эндонуклеазы рестрикции Hinf I для увеличения выхода продукта высокой степени чистоты.

Поставленная задача решается за счет изменения условий термообработки и усовершенствования хроматографической очистки продукта на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52.

Сущность изобретения. Биомассу клеток штамма H.influenzae, хранящегося в коллекции НИИ Коллекция культур микроорганизмов НПО "Вектор", разрушают в стационарных условиях с помощью ультразвука, затем суспензию выдерживают при температуре 58 - 60^oC в течение 10 мин, охлаждают и освобождают от клеточного дебриса центрифугированием. Очистку на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52 проводят путем смешивания фракции фермента с сорбентом в буфере A, содержащем 0,2М NaCl (в соотношении 1:1).

Клетки бактерий H. influenzae (необходимое количество) суспендируют в буфере A (0,01М калий фосфатный буфер pH 7,5, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЕДТА) из расчета 2 мл на 1 г биомассы и подвергают дезинтеграции ультразвуком при температуре 4^oC. После чего суспензию выдерживают при температуре 58 - 60^oC 10 мин, что позволяет снизить содержание белка не менее чем на 25 - 30%, затем экстракт освобождают от дебриса центрифугированием, а надосадок используют для дальнейшей очистки на DEAE-целлюлозе-ДЕ-52. Фракционирование на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52 проводят в буфере A в присутствии NaCl до конечной концентрации 0,2М. ДЕАЕ-целлюлозу-ДЕ-52 отфильтровывают на стеклянном фильтре под разряжением водоструйного насоса, в фермент наносят на фосфоцеллюлозу P11. Элюцию сорбированных белков проводят линейным градиентом концентрации NaCl от 0,2 до 0,6М в буфере A. Полученные фракции исследуют на наличие рестриктазы, объединяют и используют для следующей стадии очистки на гепарин-сефарозе. Элюцию сорбированных белков после диализа проводят линейным градиентом концентрации NaCl 0 - 0,6М в буфере. Фракции, дающие полный специфический гидролиз, объединяют и концентрируют диализом против 50% раствора глицерина в буфере A. Выход фермента из 10 гр клеток - 170000 - 200000 ед. акт. , что составляет 30 - 35% от общей активности фермента. Хранится препарат при минус 20 (±2)^oC не менее 12 месяцев без снижения активности. Фермент свободен от значительных примесей неспецифических эндонуклеаз: обработка ДНК фага лямбда 10-кратным избытком фермента в течение 16 ч (160-кратный избыток) при 37^oC не изменяет специфической картины гидролиза (фиг. 1).

Данный способ позволяет увеличить выход препарата фермента в среднем в 4 раза.

Существенными отличиями изобретения являются следующие:
- проведение термообработки при температуре 58 - 60^oC не менее 5 - 10 мин после обработки клеточной суспензии ультразвуком;
- проведение хроматографической очистки на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52.

Из литературных источников известно, что термообработка клеточной суспензии приводит к более лучшей очистке от клеточного дебриса [4]. Однако, как показано в эксперименте, одновременное нагревание и разрушение ультразвуком клеточной суспензии не позволяет осуществлять должный контроль за температурой нагревания, что приводит или к инактивации фермента при повышении температуры или к ухудшению очистки при пониженной температуре.

Сочетание термообработки с хроматографированием на ДЕАЕ-целюлозе-ДЕ-52 приводит к значительной очистке клеточной суспензии, что позволяет сократить число стадий дальнейшей обработки.

Поскольку предлагаемый способ получения эндонуклеазы рестрикции Hinf I предложен впервые, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На фигуре 1:
1 дорожка - гидролиз 2 мкг ДНК фага лямбда 10-кратным избытком фермента в течение 1 часа;
2 дорожка - гидролиз 2 мкг ДНК фага лямбда 10-кратным избытком фермента в течение 16 ч;
3 дорожка - контроль ДНК фага лямбда.

На фигуре 2:
1 дорожка - гидролиз 2 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 часа 10-кратным избытком фермента;
2 дорожка - 2 мкг фрагментов ДНК сшитых ДНК-лигазой;
3 дорожка - гидролиз сшитых фрагментов ДНК рестриктазой Hinf I;
4 дорожка - контроль ДНК фага лямбда.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение эндонуклеазы рестрикции Hinf I. 10 г биомассы клеток H.influenzae суспендируют в 20 мл 0,01М трис-HCl буфере, pH 7,5, содержащего 0,01М 2-меркаптоэтанол (буфер экстракции озвучивают на дезинтеграторе УЗДИ-2Т 8 раз по 30 сек. Затем клеточный гемогенат прогревают при температуре 58 - 60^oC в течение 10 мин, центрифугируют в течение 40 мин при 18000 об/мин. Полученный супернатант фракционируют на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52 в 0,01М калий-фосфатном буфере, pH 7,5, содержащем 0,01М 2-меркаптоэтанол 1 ММ ЭДТА (буфер A) в присутствии 0,2М NaCl. ДЕАЕ-целлюлозу-ДЕ-52 отфильтровывают на стеклянном фильтре под разряжением водоструйного насоса. Осветленный экстракт наносят на колонку с фосфоцеллюлозой P-11, уравновешанную 0,2М NaCl в буфере A. Элюцию сорбированных белков ведут линейным градиентом концентрации NaCl от 0,2 до 0,6М в буфере A со скоростью 20 мл/ч, объем градиента равен 300 мл. Фракции, дающие полный специфический гидролиз, объединяют. Фермент элюируется при концентрации натрия хлористого 0,3М. Для освобождения фракции от натрия хлористого проводят диализ в буфере A в течение 2 ч и наносят на гепарин-сефарозу, предварительно уравновешанную буфером A. Элюцию сорбированных белков ведут линейным градиентом концентрации NaCl в буфере A от 0 до 0,6М. Общий объем градиента 140 мл. Фракции, содержащие эндонуклеазу рестрикции Hinf I, объединяют и диализируют против 50% глицерина в буфере A. Фермент хранится при температуре минус 20^oC не менее 12 мес, не теряя активности. Выход составляет 170000 е.а. Концентрация фермента 60000 е.а./мл. Содержание примесей неспецифических нуклеаз в препарате оценивают двумя способами: обработкой ДНК фаза лямбда в течение длительного времени избытком фермента и методом рестрикция - лигирование - повторная рестрикция (фиг. 1, 2).

Пример 2. Определение активности фермента. Активность эндонуклеазы рестрикции Hinf I тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в 1,4%-ном агарозном геле. За единицу активности фермента принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 37^oC.

Пример 3. Выделение эндонуклеазы рестрикции с дополнительной стадией на гидроксилапатите. Выделение проводят по той же схеме, что и в примере 1, но с дополнительной доочисткой на гидроксилапатите. Выход фермента упал на 50%, что вероятно связано с очень низким содержанием белка в препарате фермента и его чистотой.

Пример 4. Выделение эндонуклеазы рестрикции Hinf I. Выделение проводят, как в примере 1, но без прогревания супернатанта при 60^oC. Суммарная активность фермента составляет 64000 ед/10 г биомассы. Требуется дополнительная стадия очистки из-за низкого качества фермента (содержание белка составляет 4,8 мг/мл).

Список литературы
1. Лебедев Л. Р., Пустошилова Н.М. // Тез. конф. Препаративная масштабируемая хроматография биологически активных веществ и альтернативные методы. Л., 1991. С. 89 - 92.

2. Лебедев Л.Р., Андреева И.С., Афиногенова Г.Н. и др. // Биологические науки. 1992. N 2. С. 33 - 40.

3. Kopecka H. // Bioch. et Bioph. Acta, 1975, v. 391, p. 109 - 120.

4. Пучкова Л. И. , Серов Г.Д. Способ получения рестриктаз. А.с. СССР N 1406159.

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в биохимии и микробиологии для получения эндонуклеаз рестрикции. Способ включает разрушение клеток ультразвуком, термообработку не менее 5 - 10 мин при 58 - 60^oC, центрифугирование, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52, доочистку на фосфоцеллюлозе Р-11, гепарин-сефарозе, концентрирование против 50%-ного раствора глицерина. Выход фермента составляет 170000 - 200000 ед/10 г сырой биомассы. Способ прост и технологичен. Он позволяет получить фермент, не содержащий примесей неспецифических нуклеаз и фосфотаз, содержащий незначительное количество белка. 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ получения эндонуклеазы рестрикции Hinf I, включающий разрушение клеток ультразвуком, центрифугирование, хроматографию и концентрирование, отличающийся тем, что клеточную суспензию подвергают термообработке, осуществляют хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52, доочищают на фосфоцеллюлозе Р-11, гепарин-сефарозе, концентрируют против 50%-ного раствора глицерина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что термообработку ведут не менее 5 - 10 мин при 58 - 60^oС после разрушения клеток ультразвуком. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52 ведут путем смешивания ее с буфером А, содержащим 0,2 М NaCl, выдерживания в течение 1 ч при 0 - 4^oС. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе-ДЕ-52 проводят путем смешивания фракции фермента с сорбентом в буфере А, содержащем 0,2 М NaCl, в соотношении 1:1.