СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1995 года по МПК C12P21/00 C07K1/00 C12N15/28 C12P21/00 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и позволяет получать высокоочищенный препарат лимфотоксина.

Лимфотоксин (фактор некроза опухолей β) биологически активный гликопротеин, продуцируемый Т-лимфоцитами в ответ на бактериальную или вирусную инфекцию. Среди большого многообразия биологических свойств этого лимфотоксина наибольшее значение имеет его противоопухолевая, противовирусная и иммуномодулирующая активность. Все это позволяет рассматривать лимфотоксин как перспективный лекарственный препарат для лечения онкологических, вирусных заболеваний и иммунодефицитов различной этиологии. В этой связи важной задачей является разработка способов получения высокоочищенного лимфотоксина, позволяющих получать биологически активный препарат в достаточно больших количествах.

Известны способы получения рекомбинантного лимфотоксина.

Недостатками известных способов получения лимфотоксина из клеток E.coli являются многостадийность процесса очистки, что является нетехнологичным и нередко приводит к снижению выхода и активности целевого продукта. Использование в ряде способов иммобилизованных моноклональных или других специфических антител ограничивает применение очищенного таким способом лимфотоксина в качестве медицинского препарата.

Наиболее близким к предлагаемому решению является способ, описанный в пат. Ер 0230781, 1987.

Недостатком способа, описанного в прототипе, является многоступенчатость процедуры выделения и очистки лимфотоксина из клеток E.coli, что приводит к низкой технологичности и эффективности способа в целом а также снижает выход целевого продукта.

Задачей изобретения является разработка более продуктивного и простого способа получения высокоочищенного и биологически активного рекомбинантного лимфотоксина человека.

Поставленная задача решается путем культивирования штамма-продуцента с последующим выделением и очисткой целевого продукта, причем в качестве продуцента используется штамм E.coli ВКПМ В-5279, который получают непосредственно перед культивированием, культивирование проводят при 30-32^оС в течение 20-24 ч в L-бульоне, содержащем 20 мкг/см³ хлорамфеникола, экстракцию лимфотоксина осуществляют путем ультразвуковой дезинтеграции биомассы клеток, очистку проводят с использованием гель-фильтрации на сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии на DEAE-TSK 250F-геле и СМ-сефадексе А-25.

Наиболее принципиальные особенности нового способа получения лифотоксина заключаются в следующем:
свежие трансформанты штамма-продуцента получают непосредственно перед культивированием, что значительно повышает выход конечного продукта;
культивирование проводят при пониженной температуре 30-32^оС и незначительной аэрации в течение 22-24 ч. В таких условиях основная часть синтезируемого клетками лимфотоксина находится в растворимой форме;
дезинтеграцию биомассы клеток осуществляют с помощью ультразвука без внесения лизоцима или других лизирующих клетки соединений, затрудняющих последующую процедуру очистки;
использование на этапе гель-фильтрации на сефадексе G-150 безсолевого буферного раствора позволяет непосредственно перейти к стадии ионообменной хроматографии, минуя стадии концентрирования и диализа;
весь процесс очистки включает четыре стадии в отличие от прототипа, где используют шесть этапов очистки;
выход лимфотоксина из 1 г биомассы в 6,5 раз, а удельная активность очищенного новым способом рекомбинантного лимфотоксина приблизительно в 10 раз выше описанных в прототипе.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом является более простым, продуктивным и экономичным.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Трансформация.

Получение свежих клеток штамма-продуцента E.coli ВКПМ В-5279 осуществляют традиционным способом.

2. Культивирование.

К 10 см³ L-бульона, содержащего 20 мг/см³ хлорамфеникола, добавляют 1,0 см³ трансформационной смеси и инкубируют при 37^оС. Через 12 ч клетки пересевают на 1 ч в 100 см³ свежего L-бульона, а затем весь материал переносят в сосуд с 4000 см³ L-бульона с хлорамфениколом и инкубируют 20-24 ч при 30-32^оС и умеренной аэрации.

3. Выделение лимфотоксина из клеток.

Выросшие клетки собирают центрифугированием. Осадок ресуспендируют в 0,01 М трис-НС буфере (рН 8,0), содержащем 0,1 М NaCl, из расчета 20,0 г клеток на 100 см³ буфера. Клетки разрушают на холоду путем десятикратной ультразвуковой обработки суспензии в течение 30 с с интервалом 60 с. Полученный дезинтеграт осветляют центрифугированием при 20000 об/мин в течение 30 мин и надосадок, содержащий растворимый лимфотоксин, используют для дальнейшей очистки.

4. Хроматография на сефадексе G-150.

Экстракт клеток, содержащий лимфотоксин, наносят на колонку с сефадексом G-150, уравновешенную 0,01 М трис-HCl буфером (рН 8,0). Элюирование проводят со скоростью 20 см³/ч тем же буфером. Фракции, содержащие лимфотоксин, объединяют и используют для дальнейшей очистки.

5. Хроматография на DEAE-TSK геле.

Препарат лимфотоксина, полученный на предыдущей стадии, наносят на колонку с DEAE-TSK-250F, уравновешенную 0,01 М трис-HCl буфером (рН 8,0), со скоростью 20 см³/ч. Колонку промывают тем же буфером. Элюирование проводят линейным градиентом концентрации хлористого натрия со скоростью 10 см³/ч. Фракции, содержащие лимфотоксин, объединяют и диализуют против 0,01 М Na-ацетатного буфера (рН 6,0).

6. Хроматография на СМ-сефадексе.

Препарат лимфотоксина после диализа наносят на колонку с СМ-сефадексом А-25, уравновешенную 0,01 М Na-ацетатным буфером (рН 6,0) со скоростью 20 см³/ч. Элюирование осуществляют линейным градиентом концентрации хлористого натрия со скоростью 10 см³/ч. Фракции, содержащие лимфотоксин, объединяют, диализуют против 0,01М Na-ацетатного буфера (рН 6,0) и хранят замороженным при температуре минус 70^оС.

П р и м е р 1. Трансформацию клеток E.coli с получением штамма-продуцента осуществляли традиционным способом. К 10 см³L-бульона, содержащего 20 мг/см³ хлорамфеникола, добавляли 1,0 см³трансформационной смеси и инкубировали при 37^оС и 100 об/мин. Через 12 ч клетки пересевали на 1 ч в 100 см³ свежего L-бульона, а затем весь материал переносили в сосуд с 4000 см³ L-бульона, содержащего 20 мг/см³хлорамфеникола, и инкубировали 20 ч при 30-32^оС и умеренной аэрации. Выросшие клетки собирали центрифугированием. Осадок в количестве 20 г ресуспендировали в 100 см³ 0,01 М трис-HCl буфере (рН 8,0), содержащем 0,1М NaCl. Клетки разрушали на холоду путем десятикратной ультразвуковой обработки суспензии в течение 30 с с интервалом 60 с. Дезинтеграт осветляли центрифугированием при 20000 об/мин в течение 30 с и 35,0 см³надосадка, содержащего лимфотоксин, наносили на колонку с сефадексом G-150, уравновешенную 0,01 М трис-HCl буфером (рН 8,0). Элюирование проводили со скоростью 20 см³/ч тем же буфером. Фракции в количестве 90 см³, содержащие лимфотоксин, наносили на колонку с DEAE-TSK-250F, уравновешенную 0,01 М трис-HCl буфером (рН 8,0), со скоростью 20 см³/ч. Элюирование проводили градиентом концентрации хлористого натрия (0-1 М) со скоростью 10 см³/ч. Фракции, содержащие лимфотоксин, объединили, диализовали против 0,01 М Na-ацетатного буфера (рН 6,0) в течение 18 ч.

44 см³ отдиализованного лимфотоксина наносили на колонку с СМ-сефадексом А-25, уравновешенную 0,01 М Na-ацетатным буфером (рН 6,0) со скоростью 20 см³/ч, промывали тем же буфером, элюирование осуществляли линейным градиентом концентрации хлористого натрия (0-1 М) со скоростью 10 см³/ч. Собранную активную фракцию составляющую 67 см³, диализуют против 0,01 М Na-ацетатного буфера (рН 6,0) и хранят при температуре минус 70^оС.

П р и м е р 2. Культивирование штамма, выделение и очистку лимфотоксина проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что культивирование проводили при 30^оС в течение 24 ч.

В результате осуществления способа согласно примерам 1 и 2 получают электрофоретически гомогенные препараты рекомбинантного лимфотоксина. Оценку биологической активности полученных препаратов проводят в традиционном тесте цитотоксичности на клетках мышиных фибробластов линии L-929 в присутствии актиномицина D и выражают в единицах активности на 1 мг белка. За одну единицу активности принимают такое количество белка, которое вызывает лизис 50% клеток L-929. Данные по выделению двух препаратов лимфотоксина и их характеристики представлены в табл. 1.

Полная аминокислотная последовательность лимфотоксина следующая:
MtLeuAlaHisSerThrLeuLysProAAlaHisLeuIleGlyAspProSerLysGAsnSer
LeuLeuTrpArgAlaAsnThrAArgAlaPheLeuGlnAspGlyPheSerLSerAsnAsnSer
LeuLeuValProThrSGlyIleTyrPheValTyrSerGlnVValPheSerGlyLysAlaTyr
SerProLysAThrSerSerProLeuTyrLeuAlaHisGValGlnLeuPheSerSerGlnTyr
ProPHisValProLeuLeuSerSerGlnLysValTyrProGlyLeuGlnGluProTrp
HisSerMetTyrHisGlyAlaAlaPheLeuThrGlnGlyAspGlnLeuSerThrThrAsp
GlyIleProHisLeuValLeuProSerThrValPhePheGlyPheAlaLeu
Соответствие аминокислотного состава ожидаемому подтверждают аминокислотным анализом выделенного рекомбинантного лимфотоксина. Результаты определения аминокислотного состава лимфотоксина после гидролиза 6н. HCl при 110^оС в течение 24 ч представлены в табл. 2. Рекомбинантный лимфотоксин, как и природный, характеризуется высокой стабильностью в широком диапазоне рН и температуры. Данные по влиянию указанных параметров на биологическую активность рекомбинантного лимфотоксина представлены в табл. 3.

Специфическая кроличья антисыворотка к лимфотоксину нейтрализует биологическую активность рекомбинантного лимфотоксина при инкубации в течение 1 ч при температуре 37^оС (табл. 4).

Рекомбинантный лимфотоксин проявляет противоопухолевую и противовирусную активность. В качестве модели для проверки противоопухолевого действия рекомбинантного лимфотоксина использована перевиваемая опухоль мышей С 57 В 1/6 МХ 11 (индуцированная метилхолантреном).

На чертеже представлена динамика изменения веса опухолевой ткани после пятикратного ежедневного введения рекомбинантного лимфотоксина.

Кривая А контроль, кривая Б лимфотоксин (1000 ед/мышь).

Проверка противовирусной активности рекомбинантного лимфотоксина проведена с использованием стандартной методики на клетках эмбриональных фибробластов человека М-19 и вируса везикулярного стоматита штамма Индиана. Активность выражают в международных единицах на 1 мг белка. В качестве контроля используют стандартный препарат гамма-интерферона. Результаты представлены в табл. 5.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет более простым и экономичным способом получать рекомбинантный продукт, который по физико-химическим и основным биологическим свойствам соответствует лимфотоксину человека, с более высокой удельной активностью и конечным выходом.

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: полученный непосредственно перед использованием штамм-продуцент лимфотоксина человека E.coli ВКПМ-5279 культивируют при температуре 30 32°С в течение 20 24 ч в L-бульоне, содержащем 20 мкг/см³ хлорамфеникола, клетки разрушают ультразвуком, отделяют клеточный остаток, а очистку рекомбинантного лимфотоксина из надосадочной жидкости проводят путем гель-фильтрации на сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии на DEAE TSK 250 F-геле и CM-сефадексе а-25. 1 ил. 5 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА, включающий культивирование штамма-продуцента, полученного путем трансформации Escherichia coli рекомбинантной плазмидой, содержащей последовательность природного гена лимфотоксина человека, разрушение клеток методом ультразвуковой обработки, отделение клеточного остатка и хроматографическую очистку целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм E. coli ВКПМ-5279, который получают непосредственно перед культивированием, культивирование осуществляют при 30-32^oС в течение 20-24 ч в Z-бульоне, содержащем 20 мкг/см³ хлорамфеникола, а очистку проводят с использованием гель-фильтрации на сефадексе G 150 и ионообменной хроматографии на ЕАЕ-ТSК 250 F-геле и СМ-сефадексе А-25.