СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ BSE 21 I Российский патент 2002 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биохимии и микробиологии, в частности к выделению и очистке эндонуклеаз рестрикции, синтезируемых микроорганизмами, а именно к получению эндонуклеазы рестрикции Bse21 I, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-CCTNAGG -3'. Сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) стали в настоящее время незаменимым инструментом для исследования структуры ДНК, создания рекомбинантных молекул, изучения генетического материала. В связи с этим актуальной задачей является создание методических подходов к разработке высокоэффективной технологии получения ферментов этого типа.

В каждом конкретном случае эта задача решается эмпирически, путем подбора способов и условий очистки ферментов в ходе предварительных опытов. Наиболее известными способами очистки эндонуклеза рестрикции, узнающих и расщепляющих последовательность нуклеотидов 5'-CCTNAGG -3', являются способы, приведенные в списке [1-4].

Известно несколько изошизомеров рестриктаз данной специфичности: Bst29 I, Bst30 I, SauI, SeoIII, MstII, Bse21 I и др. [1].

Для таких ферментов как Bst29 I, Bst30 I, SauI способ выделения не описан. Известен способ выделения эндонуклеазы рестрикции Sec III, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-CCTNAGG -3'. Способ состоит в разделении трех рестриктаз SeeI, Sec II, Sec 111 из штамма Synechocystis species 6701 [2] и дает очень низкий выход фермента Sec III (менее 1000 ед. акт./г биомассы) [2].

Способ выделения эндонуклеазы рестрикции MstII из штамма Microcoleus species также не описан [3].

Известен способ выделения эндонуклеазы рестрикции Bse21 I из штамма Bacillus species [4], который включает следующие стадии: разрушение клеток ультразвуком (получение грубого экстракта), центрифугирование и освобождение от дебриса, очистку на биогеле А 0,5 М, диализ, очистку на DEAE- целлюлозе, диализ, хроматографию на Р-11 фосфоцеллюлозе, диализ, концентрирование в 50%-ном глицерине. Выход фермента составляет 30000 ед./г биомассы бактерий.

Недостатком данного способа является многостадийность процесса, что всегда приводит к потерям общей активности фермента, большим материальным затратам и увеличению технологического времени.

Наиболее близким является способ выделения рестриктазы Xba I из Xanthomonas badric [5] . Способ включает разрушение биомассы ультразвуком, фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль (ПЭГ) - декстран, центрифугирование, хроматографию на гепарин-сефарозе с диффиринциацией рН, концентрирование. Выход фермента составляет 12000 ед./г биомассы бактерий. Этот способ выделения по сравнению с аналогом [4] является более экономичным по времени и содержит меньше технологических стадий, что позволяет не терять активность препарата во время его получения.

Недостатком данного способа является то, что он малоприемлем для выделения других рестриктаз, так как включает технологическую сложность на стадии проведения хроматографии на гепаринсефарозе, где требуется дифференциация рН: при подготовке сорбента - рН 7,2; в процессе элюции - 7,5. Технологически трудно проводить поддержание рН, контроль рН и изменение его при переходе от одной ступени хроматографии к другой, причем при рН 7,2 фермент Bse21 I инактивируется. Кроме того, на стадии проведения двухфазного фракционирования в системе ПЭГ - декстран при выделении Хва I необходимо строго соблюдать температуру -4±4^oС, что также усложняет технологию.

В таблице 1 приведены технологические схемы получения рестриктаз по способу прототипу, аналогу и предлагаемому способу.

Технической задачей изобретения является разработка такой технологии получения рестриктазы Bse 21 I, при которой увеличивается выход продукта и сокращается время его выделения.

Поставленная задача решается тем, что в способе, включающем культивирование клеток до стационарной фазы роста, выделение биомассы клеток, разрушение биомассы клеток ультразвуком, фракционирование в двухфазной системе ПЭГ-декстран в присутствии NaCl, центрифугирование, хроматографирование и концентрирование, и, согласно изобретению, все процессы проходят при комнатной температуре и рН 7,5, хроматографию проводят последовательно двухступенчато на фосфоцеллюлозе Р-11 и гидроксилапатите (ГАПе), причем фракционирование- в ПЭГ - декстран проводят в присутствии NaCl с концентрацией 0,2-0,3 М.

Сущность изобретения. Биомассу клеток штамма Bacillus sp., хранящегося в коллекции НИИ Коллекция культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" под номером 424, выращивают при 30^oС и интенсивной аэрации до стационарной фазы роста, ее выделяют и разрушают в стационарных условиях с помощью ультразвука, и подвергают фракционированию в системе полиэтиленгликоль-декстран в присутствии 0,2-0,3 М NaCl. Дальнейшую очистку проводят на фосфоцеллюлозе Р-11. Завершающей стадией является хроматография на гидроксилапатите и концентрирование препарата фермента в 50%-ном растворе глицерина в буфере А. Выход фермента из 10 г клеток - 300000 ед.акт. Все процессы проходят при комнатной температуре и рН 7,5.

Хранится препарат при минус 20 (±2)^oС не менее 12 месяцев без снижения активности. Фермент свободен от значительных примесей неспецифических эндонуклеаз: обработка ДНК фага лямбда 10-кратным избытком фермента в течение 16 ч (160-кратный избыток) при 37^oС не изменяет специфической картины гидролиза (см. чертеж).

Существенными признаками изобретения являются:
- изменение параметров процесса (температуры и рН 7,5 - в способе-прототипе все процессы проходят при температуре строго 4±4^oС, а хроматография протекает с дифференциацией рН, см. таблицу);
- фракционирование в двухфазной системе ПЭГ - декстран в присутствии NaCl с концентрацией 0,2-0,3М;
- хотя известен способ получения фермента Bse 21 I [4] из штамма Bacillus sp. , однако многостадийность процесса и использование многократного диализа приводит к увеличению технологического времени получения препарата фермента и снижению его выхода.

Рассматривая вышеизложенное, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже:
1 дорожка - гидролиз 2 мкг ДНК фага лямбда 10-кратным избытком фермента в течение 1 часа;
2 дорожка - гидролиз 2 мкг ДНК фага лямбда 10-кратным избытком фермента в течение 16 ч;
3 дорожка - контроль ДНК фага лямбда.

Далее следуют примеры конкретного осуществления данного изобретения.

Пример 1. Выделение эндонуклеазы рестрикции Bse21 I.

Клетки Bacillus sp. культивируют при 30^oС и интенсивной аэрацией на стандартной питательной среде до достижения стандартной фазы роста, после чего клетки собирают центрифугированием. Процесс происходит при комнатной температуре. 10 г биомассы клеток суспендируют в 20 мл 0,01М трис-НСl буфера, рН 7,5, содержащего 0,01М 2-меркаптоэтанола, озвучивают на дезинтеграторе УЗДН-2Т 8 раз по 30 с. Одновременно клеточную суспензию подвергают фракционированию в системе полиэтилен-декстран в присутствии 0,2-0,3 М NaCl, центрифугируют в течение 40 мин при 18000 об/мин.

Осветленный экстракт разбавляют в 3 раза 0,02 М калий-фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 1 mМ EDTA, 0,01М 2-меркаптоэтанола (буфер А) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11, уравновешенную буфером А. Элюцию сорбированных белков ведут линейным градиентом концентрации NaCl от 0,0 до 0,6М в буфере А со скоростью 20 мл/ч, объем градиента равен 300 мл. Фракции, дающие полный специфический гидролиз, объединяют. Фермент элюируется при концентрации натрия хлористого 0,3-0,35 М. Для освобождения фракции от натрия хлористого проводят диализ в буфере А течение 2 ч и наносят на колонку с гидроксилапатитом, предварительно уравновешенную буфером А. Элюцию сорбированных белков ведут линейным градиентом концентрации К-фосфата от 0 до 0,3М в буфере А. Общий объем градиента 80 мл. Фракции, содержащие эндонуклеазу рестрикции Bse21 I, объединяют и диализируют против 50% глицерина в буфере А. Все процессы идут при комнатной температуре. Фермент хранится при температуре минус 20^oС не менее 12 мес, не теряя активности. Выход составляет 30000 е.а./г. Концентрация фермента 40000 е.а./мл. Содержание примесей неспецифических нуклеаз в препарате оценивают обработкой ДНК фага лямбда избытком фермента в течение длительного времени (см. чертеж).

Пример 2. Определение активности фермента. Активность эндонуклеазы рестрикции Bse 21 I тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в 1,4%-ном агарозном геле. За единицу активности фермента принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 37^oС.

Пример 3. Определение степени чистоты фермента. Определяют наличие неспецифических нуклеаз в препарате. Показано, что ДНК выдерживает 160-кратный избыток фермента.

Пример 4. Выделение рестриктазы Bse 21 I. Выделение проводят как в примере 1, но при концентрации NaCl - 0,5 М при фракционировании в системе ПЭГ-Декстран. Активность фермента в 1 мл снизилась до 20000 ед/мл.

Пример 5. Выделение рестриктазы Bse 21 I. Выделение проводят как в примере 1, но фермент на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 наносят без разбавления буфером А до оптимальной ионной силы. Фермент сорбируется на смолу только частично и "выходит" в "проскоке" вместе с буферами лишь незначительное количество при хроматографии.

Таким образом, как видно из примеров, предлагаемый способ получения препарата фермента позволяет увеличить выход препарата при сокращении технологического времени.

Источники информации
1. Catalog "Biolabs", 1990/1991.

2. Calleja, F., Tandeau de Marsac, N., Coursin, Т., van Ormondt, H., de Waard. A. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 6745-6751.

3. REBASE.

4. Авторское свидетельство СССР 1518372 "Штамм бактерий Bacillus species - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bse21 I", С 12 N 9/14.

5. Авторское свидетельство СССР 1634713 "Способ получения эндонуклеазы рестрикции Xba I", опубл. БИ 10, 91.

Изобретение относится к биотехнологии, касается генной инженерии, может быть применено для исследования молекул ДНК, изучения генетического материала. Предложенный способ выделения эндонуклеазы рестрикции Bse 21 I, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GCTNAGG-3', позволяет получить фермент, не содержащий примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз, содержащий незначительное количество белка. Выход фермента составляет 3 000 000 ед/10 г сырой биомассы. Выделение эндонуклеазы рестрикции Bse 21 I ведут при комнатной температуре и рН 7,5 фракционированием клеточного гомогената в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран в присутствии NaCl с концентрацией 0,2-0,3 М. Очистку проводят хроматографией на фосфоцеллюлозе р-11 и гидроксилапатите последовательно. Способ позволяет получать до 30 000 ед. акт/г биомассы, что увеличивает выход продукта, а также сокращает технологический процесс выделения до 40 ч. 1 табл., 1 ил.

Способ получения эндонуклеазы рестрикции Bse 21 I, включающий культивирование клеток до достижения стационарной фазы роста, выделение биомассы клеток, разрушение клеток ультразвуком, фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран в присутствии NaCl, центрифугирование, хроматографию и концентрирование, отличающийся тем, что все процессы протекают при комнатной температуре и рН 7,5, хроматографию проводят последовательно двухступенчато на фосфоцеллюлозе р-11 и гидроксилапатите, а фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран происходит в присутствии NaCl с концентрацией 0,2-0,3 М.