СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОЙ СТАДИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/569 C07K14/45 C12N15/38 A61K39/245 

Способ относится к вирусологии, в частности, к экспресс-диагностике вирусных инфекций.

Цитомегаловирусная инфекция человека, как правило, протекает со слабо выраженной симптоматикой, однако, сопровождается осложнениями различной тяжести. Этот вирус является одним из основных патогенов для групп повышенного риска с различными иммунодефицитами, включая СПИД, реципиентов при трансплантации органов и тканей, когда при иммунодепрессивном состоянии происходит реактивация латентного цитомегаловируса, часто приводящая к необратимым клиническим патологиям организма человека. Кроме этого, ЦМВ-инфекция относится к разряду тератогенных, способных инициировать различные патологии при беременности, часто приводящие к серьезным аномалиям у новорожденных.

Данная инфекция характеризуется хронической формой течения и относится к разряду латентных, в связи с чем, ее диагностика клинически затруднена. Наиболее известным подходом в этом плане в настоящее время является метод выделения вируса из клинических образцов на чувствительной культуре ткани (Gleaves CA, Smith TF, Schuster EA, Pearson GR. Comparison of standard tube culture and shell viral culture techniques for the detection of cytomegalovirus in clinical specimens. J.Clin Microbiol 1985, 21: 217-221). Недостатком этого метода является продолжительность проведения анализа (до 72 часов) и неоднозначность интерпретации результатов.

В последнее время в диагностике данной инфекции используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), детектирующий специфическую нуклеотидную последовательность геномной ДНК вируса в клинических образцах (Demmler GJ, Buffone GJ, Schimbor CM, May RA. Detection of cytomegalovirus in urine from newborns by using polymerase chain reaction. J Infect Dis 1988, 158 : 1177-1184). Недостатком этого метода является выявление как активной, так и латентной форм инфекции. Эта проблема диагностики цитомегалии человека является ключевой в связи с персистирующим состоянием ЦМВ в организме.

В настоящее время наиболее адекватным методологическим подходом в этом плане считается обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), детектирующая экспрессию вирусных генов, в частности основного предраннего гена ЦМВ, в виде его специфической информационной РНК (Nagata N. et al Detection of Human CMV mRNA by RT-PCR. Sapporo Med. J. 62 (4) 1993, 193-200). Однако, данный метод пока не нашел широкого применения в практике здравоохранения по причине высокой стоимости и использования прецизионного импортного оборудования.

В связи с латентным течением ЦМВ-инфекции осложнена и ее серодиагностика. Так, для определения активной инфекции используется метод выявления вирусспецифических антител класса IgM. Однако, этот метод имеет свои ограничения, связанные прежде всего с тем, что до сих пор остается открытым вопрос о детектируемом наличии антител этого класса при рецидивирующей форме инфекции (Kangro, Н.О., Booth, J.C., Bakir, Т.М., Tryhorn, Y., Sutherland, S., Detection of lgM antibodies against cytomegalovirus: comparison of two radioimmunoassays, enzyme-linked immunosorbent assay and immunofluresc..ent antibody test. J.Med. Virol. 14:73-80, 1984).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ диагностики цитомегаловирусной инфекции человека, включающий сорбцию специфического антигена на твердую фазу, внесение испытуемой сыворотки, инкубацию с иммуноферментным конъюгатом и субстратом с последующей оценкой результатов (патент RU N 2028156, класс 6 А 61 К 39/245, 09.02.95).

Недостатком этого способа является то, что специфический иммуносорбент представляет собой ядерную фракцию клеток, полученную через 48-72 часа после их инфицирования цитомегаловирусом. Белки такой фракции представляют собой "ранние" вирусспецифические полипептиды, являющиеся продуктами экспрессии ранних (бета) генов генома ЦМВ, и составляют смесь как неструктурных, так и структурных антигенов вируса. Таким образом, специфические антитела такой смеси могут детектироваться как в активной стадии инфекции, так и при ее латентном течении.

Устранение указанных недостатков достигается тем, что для диагностики активной стадии инфекции используется рекомбинантный основной предранний неструктурный белок цитомегаловируса, аналог вирусного белка с молекулярной массой 72 кД, являющийся продуктом экспрессии предранних (альфа) генов вирусного генома. Выявление специфических антител в ИФА к данному антигену происходит только в активной стадии инфекционного процесса и позволяет дифференцировать ее от латентного течения инфекции.

Сущность способа заключается в следующем:
На твердую фазу полистироловых планшетов сорбируется рекомбинантный основной предранний неструктурный белок ЦМВ, являющийся аналогом вирусного белка с молекулярной массой 72 кД. Данный белок известен как продукт экспрессии региона IE-гена, включающего нуклеотидную последовательность между 0,66 и 0,77 положениями на физической карте длинной уникальной последовательности генома ЦМВ (Yoshihiro Tsutsui and Takako Nogami- Satake, Differential expression of the major immediate early gene of human cytomegalovirus, J. Of Gen. Virology, 1990, 71, 115-124). Однако, сведения об использовании данного антигена для диагностики цитомегаловирусной инфекции не обнаружены.

После промывания планшетов специальным буфером к антигену на твердой фазе вносится образец сыворотки или плазмы крови человека. Специфические антитела, присутствующие в образце, должны связаться с вирусным антигеном. Для выявления специфической связи антиген-антитело используется антивидовой (человеческий) конъюгат с ферментом пероксидазой хрена. После добавления субстрата и красителя комплекс антиген-антитело-конъюгат при специфическом взаимодействии дает цветовую реакцию, определяемую методом спектрофотометрии при длине волны 492 нм.

Для получения более корректных результатов в качестве контрольного антигена был использован полипептид, синтезированный в клетках E.cloi, изогенный вирусспецифическому антигену и не содержащий антигенные детерминанты цитомегалоривуса человека.

Пример:
В эксперимент были взяты образцы сывороток крови 3-х групп пациентов по 20 человек в каждой.

Первая группа: хронически инфицированные цитомегаловирусом вне стадии обострения, в сыворотке крови которых были обнаружены общие специфические IgG-антитела.

Вторая группа: пациенты с диагнозом активной цитомегалии, установленным как лабораторными методами, так и наличием клинической картины.

Третья группа: пациенты после лечения активной формы цитомегалии, находящиеся в состоянии ремиссии.

Результаты проведенного анализа представлены в следующей таблице.

Представленные в таблице данные свидетельствуют о высокой специфичности выявления активной стадии ЦМВ-инфекции при использовании в качестве иммуносорбента в ИФА основного предраннего неструктурного белка ЦМВ. Как видно из представленных в таблице данных, выявляемость IgM-антител при активной ЦМВ инфекции ниже, чем IgG-антител к основному предраннему антигену. Этот факт может быть объяснен тем, что, как было отмечено выше, образование специфических антител этого класса ограничено при рецидивирующей форме инфекции.

Данный подход дает возможность проведения быстрой и адекватной дифференциации между хронической и активной формами цитомегалии, что представляет исключительную актуальность для своевременного блокирования инфекционного процесса, а также для прогнозирования развития этого заболевания.

Кроме этого, следует отметить, что данный подход обеспечивает преимущества перед методом выявления антител класса lgM в связи с различием в динамике образования IgG-антител к неструктурным вирусным антигенам и IgM-антител к структурным антигенам, синтезирующимся на более поздних стадиях инфекционного процесса.

Изобретение предназначено для быстрой диагностики активной формы цитомегаловирусной инфекции. Способ основан на выявлении вирусспецифических антител класса IgG к рекомбинантному основному предраннему неструктурному белку цитомегаловируса, представляющему собой аналог вирусного белка с молекулярной массой 72 кД, методом иммуноферментного анализа. Данный кластер антител обнаруживается только в случае активной репликации цитомегаловируса и является маркерным для дифференциации активного и хронического течения инфекции. Изобретение дает возможность быстро диагностировать активную форму цитомегалии, что представляет исключительную актуальность для своевременного блокирования инфекционного процесса, а также для прогноза развития этого заболевания. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ диагностики активной стадии цитомегаловирусной инфекции человека, включающий сорбцию специфического антигена на твердую фазу, внесение испытуемой сыворотки, инкубацию с иммуноферментным конъюгатом и субстратом с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что в качестве антигена используют рекомбинантный основной предранний неструктурный белок цитомегаловируса, представляющий собой аналог белка с молекулярной массой 72 кД, и при выявлении антител к нему детектируют активную стадию инфекции. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют рекомбинантный основной предранний неструктурный белок цитомегаловируса человека, клонированный и экспрессированный в белок-синтезирующей системе E.coli.