ПЛАЗМИДА, НЕСУЩАЯ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ кДНК (24S РНК) ВИРУСА КРАСНУХИ Российский патент 2001 года по МПК C12N15/00 C12N15/63 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к методам генной инженерии.

Известен плазмидный клон, содержащий кДНК 24S РНК вируса краснухи, Ra 27/3 (см. Gene Bank, http:/www. ncbi.nlm.n:h gov/), нуклеотидная последовательность которого представлена на рис. 4.

А также известен плазмидный клон, содержащий кДНК 24S РНК вируса краснухи, Teryl К. Frey и др. Ru 5 (см. пат. США 5663065, C 12 N 15/00, 02.09.1997), нуклеотидная последовательность которого также представлена на рис.4. Данный клон является ближайшим аналогом.

Недостатком этих плазмидных клонов является трудность доступа к указанным геномам или их фрагментам.

Устранение указанных недостатков достигается тем, что описанным ниже способом получен собственный клон, который будет иметь широкое практическое использование.

1. Выделение изолята вируса краснухи У девочки 10 лет с клинически подтвержденным диагнозом краснухи в первый день после появления сыпи был взят носоглоточный смыв в 2 мл физраствора.

К 1,8 мл носоглоточного смыва было добавлено 0,2 мл 10-кратного раствора антибиотиков (1% раствор бензилпенициллина, стрептомицина и гентамицина) и раствор помещен в термостат на 37^oC. После 30 мин инкубации материал центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин.

Для заражения были использованы клетки линии Vero-Е6 (перевиваемая линия клеток почек зеленой мартышки), которые выращивали во флаконах с площадью поверхности 50 см². Посевное количество клеток на флакон составляло 2,5 млн (5 мл клеточной суспензии с концентрацией 500 тыс/мл). Клетки культивировали в среде Игла-МЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка. После достижения клетками сплошного монослоя (3-4-й день инкубирования клеток при 37^oC) культуральную среду сливали и проводили инкубацию с 0,1 мл вируссодержащего материала в течение 1,5 часа. Далее клеточный монослой заливали средой Игла-МЕМ, содержащей 1% эмбриональной сыворотки теленка. На четвертый день инкубации 1 мл культуральной среды заражали "чистые" клетки линии Vero-Е6 и культивировали как описано выше. После проведения 20 аналогичных последовательных процедур (пассажей) стали видимо проявляться первые признаки цитопатического воздействия на клетки вируса краснухи, который оценивали с помощью светового микроскопа по гибели 50% клеточного монослоя (ЦПД₅₀).

Через 25 пассажей наличие вируса тестировали тремя различными методами:
а) по наличию ЦПД₅₀
Титр вируса определяли методом 10-кратных разведений. Последнее разведение, при котором отмечали наличие ЦПД550 на клетках линии Vero-Е6, и являлось искомым титром вируса. Вирус титровали в стандартных 96-луночных культуральных планшетах (фирма Costar, Дания). Клетки в лунках планшета культивировали в 0,1 мл питательной среды, как было описано выше. Посевная доза клеток составляла 100 тыс/лунка. После образования монослоя (3-4-й день роста культуры при 37^oC в CO₂-инкубаторе) ростовую среду заменяли на содержащую 1% эмбриональной сыворотки теленка и вносили по 0,9 мл в каждую лунку планшета. В первую лунку вносили 0,1 мл вируссодержащей культуральной среды испытуемого образца, тщательно перемешивали, отбирали 0,1 мл и вносили в следующую лунку и т.д.

Титр вируса составлял 1000 инфекционных единиц на 1 мл испытуемой культуральной среды.

б) методом интерференции с вирусом везикулярного стоматита (ВВС)
Использовали вирус везикулярного стоматита (штамм Индиана) в разведении 10^-4. Испытуемый вируссодержащий материал (вирус краснухи) титровали как описано в разделе а), только в каждую лунку планшета дополнительно вносили 10 мкл ВВС. В лунках, в которых не обнаруживали ЦПД₅₀, наблюдалась интерференция вируса краснухи с ВВС, что свидетельствовало о его наличии в испытуемом образце.

Титр вируса краснухи, оцененный данным методом, составил 100 инфекционных единиц в 1 мл культуральной среды.

в) тестирование вируса краснухи методом бляшек под агаровым покрытием
Клетки линии Vero-Е6 культивировали, как описано выше, и через 48 часов роста культур во флаконах с площадью поверхности 50 см² их заражали испытуемым материалом в различных разведениях (10-кратных). После 1,5-часового контакта (0,1 испытуемого образца на флакон) клетки покрывали агаром следующего состава:
Покрытие N 1 в расчете на один культуральный флакон:
а) раствор Эрла 10-кратный - 0,66 мл.

б) эмбриональная сыворотка теленка - 0,78 мл.

в) сода - 0,36 мл.

г) среда Игла-МЕМ - 4,2 мл.

д) ДЕАЕ-декстран - 0,5 мл.

е) агар Нобля - 2 мл.

Покрытие N 2 (окрашивающее) в расчете на один культуральный флакон:
а) раствор Эрла 10-кратный - 1,1 мл.

б) эмбриональная сыворотка теленка - 0,34 мл.

в) сода - 0,36 мл.

г) среда Игла-МЕМ - 3,6 мл.

е) нейтральный красный (1%) - 0,6 мл.

На 4-й день после заражения клеток испытуемым материалом подсчитывали количество бляшек на 1 см² культурального флакона. Последнее разведение вируссодержащего материала, при котором обнаруживали бляшки, образованные вирусом краснухи, принимали за титр вируса в испытуемом материале.

Титр вируса краснухи, оцененный данным методом, составил 10000 инфекционных доз вируса в 1 мл тестируемого материала.

Таким образом, сопоставление экспериментальных данных по обнаружению вируса краснухи тремя независимыми методами позволяет сделать вывод о наличии вируса краснухи в испытуемом образце.

2. Концентрирование и частичная очистка вируса краснухи. Концентрирование и частичную очистку вируса краснухи проводили методом дифференциальной ультрафильтрации на приборах Minitan-S с ячейкой VVLP (фирма Millipor, США) и мембранной ячейкой с перемешиванием, модель УФМ-02 (фирма Биоспектр, Россия).

Для выделения вируса использовали 1000 мл вируссодержащей культуральной среды. Процедура выделения вируса краснухи включала следующие этапы:
1. Стерилизация образца.

Мембраны МФАС-Б-2 (0,1 мкм) и МФАС-ОС-1 (с размером пор 0,2 мкм). Конечный объем образца после данной стадии 1000 мл.

2. Концентрирование вируса и отделение белков с молекулярной массой менее 100 kD с использованием УПМ-500П мембраны (с размером пор примерно 30-40 нм). Конечный объем образца после данной стадии - 10 мл (100-кратное концентрирование).

3. Отмывка вируса от остаточных белков с молекулярной массой менее 100 kD. Вируссодержащую жидкость концентрировали еще в 10 раз с использованием мембраны УПМ-500П и промывали 150 мл 0,05 М фосфатного буфера, содержащего 0,15 M NaCl.

Таким образом, был получен 1 мл частично очищенного вируса краснухи.

3. Получение, клонирование и характеристика кДНК фрагмента генома вируса краснухи 24S РНК. Для выделения РНК вируса краснухи было взято 200 мкл частично очищенного вируса. Вирусную РНК очищали, используя стандартный набор реагентов для выделения РНК (SV total RNA isolation system, фирма Promega, США). Процедуру выделения проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору. Обратную транскрипцию проводили с помощью фермента обратной транскриптазы AMV (Promega) в 10 мкл в течение 1 часа при 45^oC с олигонуклеотидом RubRT oligo - ctatacagcaacaggtg.

Амплификацию кДНК фрагмента (24S РНК вируса краснухи) проводили методом цепной полимеразной реакции (PCR) в конечном объеме 50 мкл в термоциклере Research Minicycler, model MJ с 3 мкл образца (разведенного в 5 раз), полученного в предыдущей реакции со смесью полимераз Taq/Pfu в количестве 5u/0,1u. Праймеры, условия проведения PCR и компьютерный анализ образующихся PCR-фрагментов приведены ниже.

Прямой праймер - (Rub6428F) gtcacacccaccgttgtttcgcc, 6428 - порядковый номер начального нуклеотида 24S РНК вируса краснухи.

Обратный праймер - (Rub9755R) ctatacagcaacaggtgcggggatcta, 9755 - порядковый номер конечного нуклеотида 24S РНК вируса краснухи.

Результаты компьютерного анализа образующихся кДНК фрагментов при использовании данных праймеров и условий проведения реакции представлены на фиг 1.

Фиг. 1. Фрагменты кДНК, образующиеся в результате PCR при использовании данных праймеров и указанных (табл. 1) условий проведения реакции. Соответствие прямого и обратного праймеров геномной кДНК (24S РНК) вируса краснухи представлено на фиг. 2 и 3.

Фиг. 2. Участок кДНК, соответствующий праймеру Rub64287.

Фиг. 3. Участок кДНК, соответствующий праймеру Rub9755R.

Фрагмент длиной 3300 оснований очищали методом электрофореза в 0,8% агарозе и клонировали в вектор pGEM-T (Promega) по методу Sanger с набором реактивов Bst seq kit (laboratory of Molecular Genetics, США). Сравнение клонированной последовательности кДНК 24S РНК вируса краснухи проводили с имеющимися аналогичными последовательностями (Gene Bank, США) - клон Ru-5 и 24S РНК вируса краснухи (штамм RA-27/3). Результаты представлены на фиг. 4.

На фиг. 4 изображены: 1 - линия, представляющая собой результат компьютерного анализа исследуемых нуклеотидных последовательностей, на которой светлые участки соответствуют различающимся нуклеатидам среди представленных последовательностей; 2 - консенсусная кДНК с расположенной под ней шкалой - результат компьютерного анализа трех различных последовательностей, представленных ниже; 3 - 24S кДНК клон RU5; 4 - 24S кДНК клон RA 27/3; 5 - исследуемая (Artificial) нуклеотидная последовательность.

Как видно из фиг. 4, наблюдается 79 несовпадений нуклеотидов в трех изученных последовательностях 24S фрагментов геномов вирусов краснухи. По сравнению с ближайшем аналогом (клоном Ru5) отмечено 18 несовпадений нуклеотидов.

Таким образом, получен оригинальный клон 24S кДНК вируса краснухи, выделенный из природного изолята.

Мы заявляем:
1. Получена кДНК, соответствующая 24S фрагменту генома природного изолята вируса краснухи.

2. Полученная кДНК клонирована в вектор, способный осуществить репликацию данной нуклеотидной последовательности.

Использованный вектор является бактериальной плазмидой. Из природного изолята вируса краснухи получен плазмидный клон, содержащий кДНК 24S РНК фрагмента вирусного генома, и изучена его первичная структура. Данный клон может быть использован для создания ДНК вакцины или для получения вирусспецифических структурных антигенов для конструирования на их основе рекомбинантных вакцинных и диагностических препаратов. Неинфекционные рекомбинантные вакцины могут быть полезны при иммунизации лиц повышенного риска, включая беременных или пожилых женщин, людей с аутоиммунными заболеваниями или нейрологическими симптомами. .

Изобретение относится к биотехнологии. Из природного изолята вируса краснухи получена плазмида, содержащая кДНК 24S РНК фрагмента вирусного генома, и изучена его первичная структура. Данная плазмида может быть использована для создания ДНК вакцины или для получения вирусспецифических структурных антигенов для конструирования на их основе рекомбинантных вакцинных и диагностических препаратов. Неинфекционные рекомбинантные вакцины могут быть полезны при иммунизации лиц повышенного риска, включая беременных или пожилых женщин, людей с аутоиммунными заболеваниями или нейрологическими симптомами. 1 табл., 4 ил.

Плазмида, несущая вектор, содержащий кДНК (24S РНК) вируса краснухи с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 4 и обозначенной Artificial, и способный осуществлять репликацию кДНК (24S РНК).