СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНА КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ В КРОВИ БОЛЬНЫХ С ТОКСИЧЕСКОЙ ФОРМОЙ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Способ относится к медицине, в частности к бактериологии. Известны различные способы определения экзотоксина коринебактерии дифтерии, среди которых основными являются методы выявления его, главным образом, в процессе размножения бактерий при их выделении от больных на жидких питательных средах. Основной метод обнаружения токсина при этом заключается в введении фильтра бактерий внутрикожно различным лабораторным животным. Наиболее чувствительным в этом отношении являются морские свинки, дающие при введении токсина внутрикожно некротические поражения и погибающие при внутривенном введении (Бунин К. В. Дифференциальная диагностика инфекционных болезней. М.-1965; Данила П. ЖМЭИ, 1975,N 2, с. 21-30; Иванов Ю.А. Материалы лабораторной диагностики дифтерии, Вопр. охраны матер. и детства, 1959, N 3, с. 12-16)
В последние годы появились исследования по определению токсина в реакции непрямой гемагглюцинации с бараньими эритроцитами, сенсибилизированными антитоксическими антителами (Каральник В.В, Царевский Ю. П. Шемардин В.А. В кн. "Эритроцитарные белковые диагностикумы" Наука Каз.ССР, 1982), а также выявление токсинообразования дифтерийной палочки по ДНК-ДНК гибридизации участка ДНК fox+ бактериофага микроба соответственного за синтез токсина в бактериальной клетке (Бобков А. Ф. Бобкова М.Р. Гараев М.М. и соавт. Авт. свид. N 1616991 от 01.09.90).

Однако недостатками всех описанных методов является достаточно длительное, определение токсина как, например, у животных на 3-4 день после его инокуляции, а также сложность конструирования диагностикума для РНГА, ИФА и других способов с целью использования их для выявления токсина при размножении в жидкой питательной среде. Более того, в настоящее время отсутствуют способы индикации токсина непосредственно в материале от дифтерийных больных ( пленки из миндалин, кровь и д.р.).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ выявления токсина при размножении коринебактерий дифтерии в жидкой питательной среде с помощью антительного РНГА- диагностикума /Мазурова И.К. " Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции ". Авт. докторской диссертации в форме доклада, М. 1993 г./. Автор получал такой диагностикум достаточно сложным способом с двойной очисткой антитоксических антител на иммуносорбентных системах и с фильтратом нетоксикогенного штамма дифтерийной палочки. Дальнейшая насадка антител на эритроциты проводилась стандартным способом, а выявление токсина при размножении бактерий "ин витро" автору удалось уже при первичном посеве патологического материала от больных. С помощью такого способа автор выявлял образование токсина уже на 2-е сутки после начала исследования.

В то же время недостатком базового способа является выявление токсина при выделении от больных и невозможность его определения непосредственно в патологических материалах от пациента. В связи с этим длительность выявления токсина не может обеспечить контроль с помощью этого способа тяжести течения инфекционного процесса, его динамику у больных и эффективность сывороточного антитоксического лечения.

Кроме того, получение такого диагностикума достаточно сложно и не может быть изготовлено в практических лабораторных условиях.

В предлагаемом заявителями способе токсин коринебактерии дифтерии представляется непосредственно в сыворотке крови больных и может быть выявлен в течение 3 ч от взятия материала от больного. Способ основан на принципе, что в определенных условиях токсин, присутствующий в крови больного, связывается " ин витро " с добавленными антитоксическими антителами и сорбирует на себя эндогенный /или экзогенный/ комплемент. Последний выявляется при дополнительном внесении гемолитической системы /бараньи эритроциты+ антиэритроцитарная гемолитическая сыворотка; изменение уровня комплемента при этом определяется по каталазной активности лизата эритроцитов с помощью перекисного метода, расщепление перекиси и образование атомарного кислорода меняет цветность вводимого ортофенилендиамина, определяемую в дальнейшем на иммуноферментном анализаторе при длине волны кумулятивно с 492 по 600 нм.

Чувствительность метода позволяет выявить токсин в крови больных в острой фазе заболевания при наличии эндогенного комплемента у больного. При отсутствии его в крови в реакционную смесь вносят эндогенный комплемент /сыворотку морской свинки/ в соответствующей дозе.

Метод осуществляется следующим образом.

В сыворотке, взятой у больного с дифтерийной интоксикацией в острой фазе болезни до лечения серотерапией, определяют уровень эндогенного комплемента, соединяя 0,1 мл сыворотки с 0,2 мл гемолитической системы, состоящей из равных объемов 0,7% бараньих эритроцитов и 10 гемолизирующих доз антисыворотки к этим эритроцитам. После определения в сыворотке больного комплемента ее разводят в пределах 1:2-1:10 в зависимости от содержания комплемента, так чтобы в разведении сыворотки содержалось 1-2 дозы комплемента.

Основа способа заключается в соединении 0,1 мл такой разведенной сыворотки с 50-100 антитоксических доз противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки /чаще всего это количество антитоксина содержится в разведении этой сыворотки 1:50-1:100/. Антитоксическую сыворотку вносят в равном объеме 0,1 мл. После часового контакта такой смеси в суховоздушном термостате при 37^o в смесь вводят указанную выше гемолитическую систему, состоящую из 0,7% бараньих эритроцитов и 10 гемолизирующих доз антиэритроцитарной сыворотки. Далее указанную смесь параллельно с соответствующими контролями выдерживают в суховоздушной бане до появления начальных этапов гемолиза в контроле, содержащем испытуемую сыворотку больного, разведенную вместо антитоксической сыворотки на мединалово-вероналовом буфере.

Учет гемолиза с помощью последовательного внесения в исследуемый материал 0,5 мл 0,2%-ного раствора ортофенилендиамина и 3,0%-ной перекиси водорода, затем после 1-5 минутного выдерживания проб в них добавляют по 1,0 мл 1 N раствора серной кислоты.

Цвет проб учитывают на иммуноферментном анализаторе при суммарной длине волны в пределах 492-600 нм от контроля нормальной лошадиной сыворотки, соединенной с испытуемой сывороткой в аналогичных основной пробе разведениях. Снижение показателей оптической плотности в пробе испытуемая сыворотка + антитоксическая сыворотка по сравнению с пробой испытуемой сыворотки ниже стандартного вариационного отклонения анализатора /5-8%/ означает наличие в крови больного дифтерийного экзотоксина.

В качестве дополнительного контроля в исследование включается проба, где исследуемая сыворотка соединяется с антитоксической сывороткой, из которой иммуноглобулин G удален одним из известных современных тестов. Лучше всего для этого использовать стафилококковый реагент, выпуска Института эпидемиологии и микробиологии им.Пастера /г. Санкт-Петербург/. Введение этого реагента в антитоксическую сыворотку удаляет в течении 45 мин весь Ig G и соответственно антитоксические антитела. Надосадок после цетрифугирования стафилококка практически этих антител не содержит.

Качественный учет наличия токсина в исследуемой сыворотке может быть дополнен количественной оценкой. Для этого в аналогичном тесте необходимо титрование токсина с известным его количеством /в международных единицах или других количественных характеристиках/ и стандартный перерасчет единиц токсина, исходя из его калибровки по стандарту. При расчете доз токсина разница в оптических единицах пересчитывается с учетом показателей оптической плотности в контроле, содержащем испытуемую сыворотку и нормальную лошадиную сыворотку в соответствующих опытной пробе разведениях.

Пример 1.

Больной Зайцев, 2г. 2 мес. Ранний период токсической формы дифтерии.

При определении токсина в крови больного в острой фазе заболевания выявлено (см. таблицу)
Относительная величина наличия токсина в испытуемой пробе 0,057.

Относительная величина активности токсина 0,057 0,105 0,54, в процентах 54%
Преимуществом данного способа является следующее: во-первых, в отличие от прототипа, экзотоксин определяется непосредственно в крови больных, что дает возможность оценить у больного экспрессно, в течение нескольких часов, тяжесть заболевания и дать прогноз в отношении его дальнейшего лечения. Это практически невозможно при определении экзотоксина базовым способом, так как с его помощью токсин определяется в популяции выделенных бактерий дифтерии, а не непосредственно в организме больного. Базовый способ таким образом исключает роль организма в развитии токсического дифтерийного процесса. Во-вторых, выявление токсина в заявляемом способе позволяет прослеживать эффективность пассивной серотерапии противодифтерийной антитоксической сывороткой, оценивая степень снижения токсина в крови больных.

Кроме того, при использовании данного способа возможно параллельное определение в крови иммунных комплексов (ИК) аналогичным комплемент-сорбционным тестом. До лечения сывороткой эти иммунные комплексы предположительно являются комплексами токсина и антитоксических антител, вырабатывающихся в организме больного. После начала серотерапии это главным образом образующиеся "де ново" комплексы токсина и вводимых антитоксинов. Получаемые в этом случае данные (определение токсина и ИК) легко сопоставимы и могут быть включены в систему контроля указанного специфического лечения.

И, наконец, существенным преимуществом заявляемого способа является конечный цифровой показатель результатов (количественное определение). Это дает возможность выявлять токсин в определенном одном разведении исследуемой сыворотки без его титрования, так как определение токсина с помощью титрования меняет соотношение белков сыворотки, что может существенно искажать результаты определения токсина базовым способом.

Способ относится к медицине, в частности к бактериологии. Способ основан на выявлении экзотоксина в сыворотке крови больных в остром периоде заболевания до серотерапии. Авторы предлагают определять в сыворотке крови уровень эндогенного комплемента, затем разводить до содержания комплемента 1-2 гемолизирующих дозы, вносить 50-100 антитоксических доз противодифтерийной антитоксической сыворотки и через 1 ч инкубирования при 37^oC определяют уровень задержки эндогенного комплемента по каталазной активности лизированных эритроцитов, вносимых в реакционную смесь в комплексе с 10 гемолитическими дозами антиэритроцитарной сыворотки. 1 табл.

Способ определения экзотоксина коринебактерий в крови больных с токсической формой дифтерийной инфекции путем инкубации источника экзотоксина, выделенного в остром периоде заболевания с антитоксическими антителами, и количественного учета реакции, отличающийся тем, что используют сыворотку крови больных до серотерапии, разведенную до содержания комплемента 1 2 гемолизирующей дозы, инкубируют ее с 50 100 антитоксическими дозами противодифтерийной антитоксической сыворотки в течение 1 ч при 37^oС, вносят в реакционную смесь эндогенный комплемент с 10 гемолитическими дозами антиэритроцитарной сыворотки и определяют степень гемолиза по каталазной активности.