Изобретение относится к молекулярной генетике и касается идентификации вирусов и бактерий методом сэндвич-гибридизации.
Целью изобретения является повышение чувствительности способа.
Повьшение чувствительности обнаружения- бактерий Chlamydia цитомегало- вируса,. вируса простого герпеса, ви-- руса папиломы человека, обеспечивается за счет использования серий чередующихся фрагментов нуклеиновых кислот, нанесенных на твердый носитель и меченных реагентов.
Пример 1. Фрагменты ДНК, пригодные для диагностики группы Chlamydia trachomatie, приготавливают из дак Chlamydia trachomatis серотипа L 2. Данную ДНК извлекают и фрагмен- тируют известными способами, полученные фрагменты ДНК клонируют в плазми- ду pBR322 и переносят в организм хозяина Escherichia coll К12 HBlOl известными способами. В результате данного клонирования получают генный банк бактерий Chlamydia trachomatis L 2, т.е получают большое число ре- комбинантных плазмид, каждая из которых имеет раздельный ограничительный фрагмент Ват HI от ДЖ хламидии, Для получения реагента из генного банка отбирают рекомбинантные плазми- ды, содержащие максимально большие вставки ДНК, полученные от ДНК хла- двдий. Одну такую плазМИДУ обозначают рКТН1220, которую сдали на хране- ние в Центр коллекций культур Deutsche Sannnlung von Microorganismen под номером (DSM2825), и пригодность которой для использования в качестве реСП ю
00
р сд
со
см
агента демонстрируют способом прямой гибридизации. Испытание прказало, что рКТН1220 идентифицирует все нуклеиновые кислоты от различных серотипов Chlamydia trachomatis, но не идентифицирует никакие другие нуклеиновые кислоты.
Фрагменты, полученные с использованием различных эндонуклеаз рестрик- ции, получают от ДНК плазмиды и некоторые из этих фрагментов переносят при последующем клонировании в плазмиду рАТ153 и некоторые в фаг К13 Фрагменты, принадлежащие к серии в, используют как меченые пробы, В табл, приведены размеры этих фрагментов и векторов, используемых для последующего клонирования, названия рекомби- нантных плазмид и их использование,
Фрагменты, приведенные в табл, 1, выделяют из агарозного геля методом электроэлюирования и клонируют в соответствующие сайты рестрикции векторов приведенных в табл 1, используя для этого уже известные способы.
Фрагмент BamKl-BamHl 2, кв получают следующим образом. Фрагменты BamHl Sall 1,4 KB и Sal I-Bam К I 0,7 KB плазмиды рКТН1220 разделяют гель электрофореза в агарозном геле, из которого их.извлекают, Очищенные фрагменты связьтают друг с другом посредством фермента Т4 лигазы, и из фрагментов ДНК 2, кв, полученных в данной реакции, те которые имеют свободные концы Ват HI, . дополнительно св-язьюают с ограничительной точкой Ват HI двойной молекулярной нити фаговой ДНК М13 шр 8.
Таким образом получают рекомбинант ный фак-ДНК (inKTH 245), .содержащий ДНК Chlamydia trachomatis, включающую два раздельных фрагмента ДНК, которые не располагаются непосредственно рядом друг с другом в данном геноме. Однако в данном геноме их располагают по соседству с рКТН1250 и рКТН1254 ДНК-реагентами, которые связаны с .фильтром.
Проводят исследование чувствительности ряда нуклеиновых кислот как реагентов в сравнении с непрерывной парой реагентов, используя способ сэндвич-гибридизации. Данное испытание осуществляют с использованием фильтров, каждый из которых содержит 10 молекул как рКТН 250 (а), так и
рКТН1252 (а) ДНК в виде одной мо- ;лекулярной нити. Исследуемый образец представляет собой плазмиду рКТИ 1220, которая в данном испытании вытягивается в одну нить при кипении в течение 5 мин в 0,17 М NaOH, после чего температуру снижают до О С и осуществляют нейтрализацию равномоляр- ным количеством уксусной кислоты, В данном испытании используют нижеследующие пробы меченые 125ц, - перечисленные в табл. 1: (Ь), тКТН1239 (Ь), inKTH1248 (b ) и тКТН1245 ().
Гибридизацию осуществляют при в течение 17 ч в растворе гибридизации, имеющим следзтощий состав: 4 х X SS С, 0,02% Ficoll, 0,02% поливинилг пирролидона. О,2% додедилсульфоната натрия (SDS) и 200 мкг/мл ДНК спермы сельди. Фильтры промьшают в течение 2 ч при 50 С цромьюочным раствором, имеющим следующий состав: 0,1 х SSC, 0,2% SDS, и осуществляют подсчет с использованием гамма-счётчика. Результаты приведены в табл. 2 и каждьй результат представляет собой среднее значение пяти параллельных испытаний.
Статистически рассчитывают,что 95% допустимый предел испытаний, осущест- вляемых без образца (отрицательный контрольный), рассматривается как нижний предел позитивности. Эти значения составляют 52-54 отсч/мин, когда проба представляет собой Ь i 58 отсч/мин, когда проба представляет собой Ь . 56- отсч/мин, когда проба представляет собой Ь, и 65 отсч/мин, когда проба представляет собой(. bj.
Пример 2. Образцы, взятые от трех мужчин, страдающих уретритом, и от трех женщин, страдающих цервици- том, отбирают для испытания. Chlamydia trachomotis берут из мочеиспускательного канала мужчин, женские образцы берут из шейки матки женщин. Кроме того, приводят исследование соответствующего числа аналогичных -образцов пациентов, из которых хламидии не отбирают. Подвергаемые исследованию образцы отбирают с помощью тампонов с хлопковыми концами, которые погружают в буферный раствор с растворенным образцом хламидии, содержащий 0,2 М сахарозы, 20 мК фосфатного буфера. 3% сьюоротки плода теленка.
20
25
10 мкгАмл гентамицина, 100 мкг/мл ван- комицина и 25 ед/шт нистатина.
Хламидии из данных образцов подвергают культивированию. Исходные образцы также анализируют посредством сэндвич-гибридизации с использованием ряда фрагментов нуклеиновых кислот. Данные образцы концентрируют с использованием 2-бутанола с целью удаления . из них жидкости таким образом, чтобы конечный объем составлял примерно 80 мкл, и таким образом концентрация этих образцов для испытания возрастает примерно в 3-7 раз. После этого в образец вводят 70 мМ этилендиаминтет- рауксусной кислоты (EDTA), 0,7% доде- цилсульфата натрия (SDS), 20 мкг/мл фермента К протеиназы и осуществляют обработку в течение 15 мин при 55°С и в течение 45 мин при 37°С, После этого образец кипятят в течение 5 мин в 0,175 М NaOH. Подвергнутый кипячению образец охлаждают до 0°С. и нейтрализуют равномолярным количеством уксусной кислоты и подвергают испытанию. В испытании используют фильтры в условии гибридизации, описанные в примере 1. Используемая проба представляет собой тКТН 1245 () 300000 отсч/мин 400 мкл раствора гибридизации.Результаты гибридизации представлены в табл. 3.
Предел позитивности в данных испытаниях составляет 104 отсч/мин.
Результаты, приведенные в . 3, показьгоают, что сэндвич-гибридизация, осуществляемая с использованием ряда фрагментов нуклеиновых кислот, пригодна для диагноза венерических забоеваний. Образцы, которые бьти негативны при испытаниях культуры, были также негативны в испытании сэндвичгибридизацией.
Пример 3, Фрагменты ДНК, пригодной для диагностики цитомегало- ируса, приготавливают из цитомегало- ируса (AD169, АТСС VR-538)-(CMV), ДНК вьщеляют и фрагментируют уже известными способами. Фрагмент 1 Е coRI линой примерно 9 кв извлекают из агарозного геля путем электроэлюиро- ания после того, как отделяют фрагенты EcoRI на основе их размера. люированную ДНК экстрагируют феноом, после чего ее осаждают этанолом. чищенную таким образом ДНК связьша- т посредством Т-4 лигазы с вектором
15
30
35
40
45
50
55
0
5
плазмиды рВ 325, обработанным EcoRI ферментом, образующуюся рекомбинантную ДНК переносят в бактериального хозяина Е. coli К12 HBIOI. Из числа стойких к ампициллину и тетрациклину, но чувствительных к хлорамфениколу клонов выбирают такой, которьй содержит специфическую для цитомегаловируса вставку ДНК необходимого размера. Характер клонированной ДНК цитомегаловируса определяют методом нанесения пятен Southern. Такое испытание показывает, что описанный фрагмент 5 EcoRI-ДНК размером 9 кв получен от ДНК цитомегаловируса и, в частности, он включен в его фрагмент Hind III D, Описанную рекомбинантную плазмиду обозначают как рКТН127 и сдают на хранение в Центр коллекции культур Deutsche Sammlung von Microorganis- men под номером DSM 2826.
Последующие клонирования осуществляют уже известными способами с использованием в качестве векторов плазмиды рВ 322 и фагов К13 тр7 и К13 тпрВ. Ряд фрагментов нуклеиновых кислот приготавливают с использованием ограничительных фрагментов Е coRI, Bam HI, Cla I и Pst I, В табл. 4 приведены размеры данных фрагментов и векторы, используемые для дальнейшего клонирования, и даны названия образуемых таким путем рекомбинантных плазмид и их использование либо в качестве фильтр-реагентов, либо в качестве меченых проб.
0
5
0
5
0
5
Исследуют чувствительность ряда нуклеиновых кислот как реагентов в сравнении с непрерывной парой реагентов с использованием способа сэндвич- гибридизации. Образец для испытания в данном случае представляет собой ДНК СШ (ДНК цитомегаловируса) , который подвергают кипячению в 0,17 К NaOH в течение 5 мин и затем нейтрализуют, как и в примере 1, В данном испытании используют фильтры, каждый из которых содержит молекул как РКТН1273 (а,)ДНК, так и рКТН1274 (а.) ДНК, в виде однониточной молекулы, и нижеследующие пробы, меченые 125, перечисленные в табл. 4: тКТН1277 (Ъ тКТН1278 (Ъг) и ТН1.279 (Ц).Каждая из проб содержит 10 отсч/мин/мкг ДНК. Гибридизацию осуществляют как описано в примере 1, Полученные результаты приведены в табл, 5,
в данном испытании нижний предел позитивности составляет отсчетов/мин, когда проба представляет собой Ь . Ь2. или Ь 59 отсч/мин, когда проба представляет собой Ь,, Ь и 63 отсч/мин, когда проба представляет собой Ъ bj.
Результаты, приведенные в табл.5, показьшают, что сэндвич-гибридизация, в которой используют индивидуальную
пробу реагент(Ь
или
Ьз)
в
Реагенты в испытании гибридизацией
35
каждом случае обнаруживает 4x106 молекул ДНК СМ V. С другой стороны представляют собой рКТН 1273 (а,) и
рКТН1274 (а) на фильтрах итКТН1277 (Ь), тКТН1278 (bJ,wKTH1279 (Ь)в качестве проб, каждьй 200000 отсч/мин на реакцию. В других случаях гибридизацию, промьшку и отсчет результатов осуществляют как описано в примере 1,
Результаты данной гибридизации приведены в табл. 6.
Результаты, представленны в табл.6, показывают, что используя ряд нуклеиновых кислот как реагентов, можно обнаружить цитомегаловирус с различных клинических образцах, таких как моча, образцы биопсии легкого и клетки.
Данное испытание специфично для цитомегаловируса, оно не идентифицирует ДНК человека, т.е. данному испытанию не препятствует ДНК человека, присутствующая в испытьшаемом образце. Фактически тип образца не влияет на специфичность данного испытания.
Формула изобретения
Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-г.иб- ридизации нуклеиновых кислот, включающий контактирование пробы нуклеиновой кислоты с первым фрагментом нуклеиновой кислоты, нанесенным на твердый носитель реагентом, и вторым фрагментом нуклеиновой кислоты, меченым реагентом, с последующим радиоактивным анализом, отличающий- с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, при идентификации бактерий рода Chlamydia берут две серии чередующихся фрагментов нук- леиновой кислоты, причем в качестве реагентов, нанесенных на твердьй носитель, используют фрагменты Glal- Sal I размером 3,0 KB и Sal I - Cla I размером 2,9 KB плазмиды pKTH1220, субклонированные в векторе pAT153,
ридизация, осуществляемая с реагентом (Ь, Ъ или Ь, . Ь), обнаруживает лишь 10 молекул ДНК CMV. Данные результаты показьшают, что ряд нуклеиновых кислот, как реагентов, 20 в четыре раза чувствительнее индивидуальных .нуклеиновых кислот, как реагентов .
Клинические образцы подвергают анализу путем сэндвич-гибридизации с 25 использованием ряда реагентов. Эти образцы включают два образца мочи, взятой у детей до одного года. Эти дети страдают врожденным большим эритроцитом (CMV). Данным способом сэнд- , ВИЧ-гибридизации анализируют также образец, взятый путем биопсии легкого у пацие.нта с инфекционным легочным ци томегаловирусом (СКУ). В качестве образцов в данном испытании используют также зараженные и незараженные цитомегаловирусом клетки человеческого 3 ародьщ1а.
В 10 мл образца мочи вводят раствор, содержащий % саркозила и 5 мК этилендиаминтетрауксусной кислоты и 200 мкг ДНК от зобной железы теленка, после чего ДНК, выделенную из вируса, вместе с носителем осаждают, используя 10 мл изопропанола, при комнатной температуре. Осажденную ДНК растворяют в 200 мкл буферного раствора ТЕ и переводят в форму однониточной молекулы путем кипячения в течение 5 мин, после чего раствор ДНК охлаждают до О С и вводят в раствор гибридизации.
Образец биопсии легкого (несколько ММ ) механически измельчают ножом и в него вводят 200 мкл буферного раствора IE, содержащего 1%-ного раст- вора додецилсуль(51а.та натрия (SDS) и 1 мг/мл фермента К протеиназы. Вываривание осуществляют в течение 1 ч
40
45
50
0538
при , после чего образец про- .пускают дважды в шприц для инъекции чер ез тонкую подкожную иглу. Гомоге- низированный таким путем образец подвергают кипячению, после чего его вводят в испытьюаемый раствор.
Зараженные цитомегаловирусом клетки и незараженные клетки разрушают Q под действием додецилсульфата натрия и К протеиназы, гомогенизируют и подвергают кипячению, как указано выше .
Реагенты в испытании гибридизацией
5 представляют собой рКТН 1273 (а,) и
,j мечеными реагентами являются фрагменты Sal I - Bam HI размером 0,7 KB, Bam HI - Sal I размером 1,4 KB и Cla I - Cla I размером 1,7 KB плазми- ДЫ pKTH1220, субклонированные в фаг Ml 3 mp8, причем фрагменты Sal I - Bam HI и Bam HI - Sal I сшиты между собой с образованием фрагмента Bcim HI - Bam HI размером 2,1 KB, при иденти- Q фикации цитомегаловируса в качестве нанесенных на носитель реагентов используют фрагменты EcoR I - Pst I размером- 3,3 KB и Cla I - Bam HI размером 3,0 KB плазмиды pKTH1271, субклони- j рованные в вектор pBR 322,, a в качестве меченых реагентов используют фрагмент Pst I - Pst I размером 0,6 KB плазмиды pKHTl271, субклонированный в плазмиду М13 тр 7, и фрагменты JQ Pst I - Cla I размером 1,0 KB и Bam HI- EcpR I размером 1,0 KB плазмиды pKTH 1271, субклонированные в фаг M13mp8, при идентификации вирусов простого герпеса типа 1 в качестве реагентов, 25 нанесенных на твердый носитель, ис- пользугот два фрагмента EcoRI-Pst I размером 1,1 кв и два фрагмента Pst I- Bam HI размером 1,5 KB плазмиды
рКТН1359 субклонированных в фаги М13 mplO и М13тр11, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент Hind III - EcoR I размером 1,9 KB плазмиды рКТН 1359, субклонированньй в плаз- .миду pBR325, фрагменты Pst I- Pst I размером 1,8 KB и Hind III - Bam HI размером 1,3 KB плазмиды pKTH Г359, субклонированные в плазмиду pBR322,
Q Q 5
0
5
и при идентификации вирусов простого герпеса типа 2 в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют два фраг мента Hind Ill-Pst I размером 2,0 KB и два фрагмента Pst I- Hind III размером I,2 KB плазмиды рКТН135, субклонированные в фаги М13тр 10 и MI3mp 1I, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент Pst I - Pst I размером 5,7 KB плазми- ды рКТН 1351, субклонгрованный в плаэ- миду pBR322, и при дополнительной . идентификации вируса папиломы человека типа 11-ЧПВ 11 в качестве реагентов нанесенных на твердый носитель, используют два фрагмента Ват Hl-Pst I размером 1,4 кв, два фрагмента Psti I- Pst I размером 0,8 кв и два фрагмента Pst I - Pst I размером 0,9 кв генома ЧПВ 11, субклонированные в фаги М13 fflp 10 и К13 mp 11, а в к,честве меченых реагентов используют два фрагмента Pst I - Pst I размером 1,7 кв и 1,5 кв генома вируса папиломы человека типа 11, субклонированные в плазмиду pBR 322, и при ьщентифика- ции вируса папиломы человека типа 16 в качестве реагентов, нанесенных на твердый носитель, используют по два фрагмента Pst I - Pst I размером 1,7- KB и 1,1 KB генома ЧПВ 16, субклонированные в фаг М13тр 10, а в качестве меченых реагентов используют фрагмент Ват HI - Pst I размером 2,7 KB и 0,5 KB генома вируса папиломы человека типа 16, субклонированные в плазмиду рВИ 322.
Изобретение относится к молекулярной генетике и касается идентификации вирусов и бактерий методом сэндвич-гибридизации. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Повышение чувствительности обнаружения бактерий CHLAMYDIA цитомегаловируса, вируса простого герпеса, вируса папиломы человека обеспечивается за счет использования серий чередующихся фрагментов нуклеиновых кислот, нанесенных на твердый носитель, и меченых реагентов. 6 табл.
Таблица 1
11
1523053
Ъ;, - 380000отсч/мин/испытаиие; 5-10 отс/мин/ мкг ДНК
Ъ2 - 340000отсч/мин/испытание; 4-10 отсч/мин/ мкг ДНК
Ъ, - 350000отсч/мин/испытано; отс- /мин/мкг ДНК}
- 310000отсч/мин/испытание; 7-10 отсч/мин/мкг ДОК;
Ъ, Ъ - 700000отсч/мин/испытание;
(ь,-Ъ) Ьз- 700000отсч/мин/испытаяие
Таблица 3
12
Та6лица2
ТаблицаА
35 38 85 203
Ъ
310000отсч/мин/испытание;
320000отсч/мин/испытание;
300000отсч/мин/испытание;
300000отсч/мин/каждого испытания;
3 300000отсч/мин каждого испытания,
1 Таблица 6
38 46 142 265
45 95 205 415
53 125 292 645
| Патент США № 4486539, 436-504, 1984. |
