КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРЕПАРАТ КОАГУЛЯЦИОННОГО ФАКТОРА VIII, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА В КАЧЕСТВЕ СТАБИЛИЗАТОРА Российский патент 1999 года по МПК A61K35/16 A61K38/37 

Изобретение относится к новым композициям, содержащим фактор коагуляции VIII и неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как блок-сополимер, например, полиоксамер, или сложный эфир полиоксиэтиленового (20) производного сорбита с жирной кислотой, в частности, полисорбат 20 или полисорбат 80. Композиция может также включать хлорид натрия, хлорид кальция, L-гистидин и/или сахара и/или спирты сахаров.

Гемофилия является врожденным заболеванием, которое известно в течение многих столетий, однако лишь в последние три десятилетия удалось различить ее разновидности: гемофилия A, гемофилия B и гемофилия C. Гемофилия A является наиболее часто встречающейся формой. Это заболевание поражает лишь мужчин с частотой один или два индивидуума на 10000 мужчин. Болезнь является следствием сильно пониженного уровня содержания или отсутствия биологически активного фактора коагуляции VIII (антигемофильного фактора), представляющего собой белок, который обычно содержится в плазме. Клиническое проявление гемофилии выражается в сильной тенденции к кровотечению, и до введения в практику лечения с применением концентратов фактора VIII средняя продолжительность жизни таких пациентов составляла менее 20 лет. Концентраты фактора VIII, полученные из плазмы, доступны уже в течение трех десятилетий. Это значительно улучшило возможность лечения пациентов, болеющих гемофилией, и позволило им вести нормальный образ жизни.

Терапевтические концентраты фактора VIII до недавнего времени готовили фракционированием плазмы. Однако в настоящее время разработаны новые способы получения фактора VIII в клеточных культурах, в которых применяют методики с использованием рекомбинантной ДНК, как это описано, например, J. Gitschier et al., Nature 312, 330-337, 1984 и в Европейском патенте 160457.

Концентраты фактора VIII, выделенные из плазмы человека, содержат несколько фрагментарных полностью активных форм фактора VIII (Anderson et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, Vol. 83, 2973-83, May 1986). Наименьшая активная форма имеет молекулярную массу 170 килодальтон и состоит из двух цепочек с массами 90 килодальтон и 80 килодальтон, которые связаны друг с другом мостиком из иона металла (см. Европейский патент 197901). Фирма "Kabi Pharmacia" разработала производное рекомбинантного фактора VIII, соответствующее форме фактора VIII из плазмы, который имеет массу 170 килодальтон в терапевтических концентратах фактора VIII. Молекулы усеченного фактора VIII называют r-VIII SQ и производятся в виде конечного продукта клетками яичников китайских хомяков в процессах с использованием клеточных культур.

Удельная активность r-VIII SQ может составлять более 12000 м.е./мг белка и предпочтительно составляет более 14000 м.е./мг. Наблюдалась активность около 15000 м.е./мг. Активность приблизительно 10000 м.е. VIII:C на мг белка была ранее продемонстрирована для нашего r-VIII SQ.

Рекомбинантный фактор VIII SQ рекомендован для лечения классической гемофилии. Дозировка аналогична дозировка в концентратах фактора VIII из плазмы. Благодаря возможности получать в настоящее время высоко концентрированные препараты, для инъекции необходимы лишь небольшие объемы.

Общие сведения о структуре и биохимии рекомбинантных производных фактора VIII описаны Кауфманом в Tibtech., Vol. 9, 1991 и в Hamatology, Vol. 63, 155-65, 1991. Структура и биохимия r-VIII SQ описана в Международном патенте WO 91/09122.

Стабильность белков является общей проблемой в фармацевтической промышленности. Часто ее решают путем высушивания белка с применением различных способов сушки, таких как сушка замораживанием. После этого белки расфасовывают и хранят в сухом виде.

Раствор перед проведением осушки или сублимационной сушки, сухое вещество и вновь восстановленный из него продукт должны быть стабильными, так чтобы не слишком большое количество активности было потеряно в процессе осушки, во время хранения и при использовании.

Фактор VIII, выделенный фракционированием из плазмы, обычно продается в виде лиофилизующегося порошка, который перед употреблением необходимо разбавить водой.

Составы с небольшим количеством белка в общем случае теряют активность в процессе очистки, стерилизации, упаковки во время приема лекарства. Эту проблему обычно решают введением альбумина человека, который значительно снижает потерю активности активного белка. Альбумин человека играет роль общего стабилизатора при проведении очистки, стерилизации в процессе производства и сублимационной сушки (см. обзор Wang et al., J. of Parenteral Sci. and Tech. , Vol. 42, N 42, Supplement 1988). Альбумин человека способствует также образованию пирожка при сублимационной сушке. Использование альбумина для стабилизации фактора VIII известно и используется в настоящее время во всех поступающих на рынок высоко чистых производных фактора VIII.

Однако добавление альбумина в терапевтический белок, получаемый по технологии рекомбинантной ДНК нежелательно. Использование альбумина человека в качестве вспомогательного вещества часто ограничивает возможности многих наиболее мощных и чувствительных аналитических методов, используемых для исследования белков.

Необходимо получить свободные от альбумина композиции, содержащие фактор VIII, в частности рекомбинантный фактор VIII, которые были бы устойчивы при проведении осушки или сублимационной сушки, стабильны в растворе или в виде раствора после приготовления препарата из порошка.

Для стабилизации различных белков было предложено несколько решений:
В Европейском патенте 35204 (Cutter) описываются методы, которые обеспечивают термическую устойчивость белковой композиции в присутствии полиола.

В Европейском патенте 381345 (Corint) приводится жидкость, содержащая белок десмопрессин в присутствии карбоксиметилцелюллозы.

В Международной патентной публикации WO 89/09614 (Genentech) описывается стабилизованный состав, включающий гормон роста человека, который содержит глицин, маннит и буфер, а в предпочтительном варианте осуществления изобретения также и неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80. Неионогенное поверхностно-активное вещество вводится для уменьшения аггрегирования и денатурации. Состав обладает повышенной стабильностью в виде лиофилизованных композиций и после их растворения в носителе.

В Европейском патенте 268110 (Cetus) заявляется раствор, включающий конкретный белок интерлейкин-2, который растворяют в среде инертного носителя, включающего в качестве солюбилизатора/стабилизатора неионогенное полимерное поверхностно-активное вещество. Предпочтительными детергентами являются полиоксиэтилированные октилфеноксипроизводные этанола, производные моностеарата полиэтиленгликоля и сложные эфиры полиэтиленсорбита и жирных кислот.

В Патенте США 4783441 (Hoechst) приводится водный раствор, включающий белок, такой как инсулин, и поверхностно-активное вещество.

В Патенте США 4165370 (Coval) описывается раствор гаммаглобулина и способ его приготовления. Раствор содержит полиэтиленгликоль. В раствор может добавлять неоногенное поверхностно-активное вещество.

В Европейском патенте 77870 (Grеen Cross) заявляется способ повышения устойчивости растворов фактора VIII, заключающийся в добавлении аминокислот, моносахаридов, олигосахаридов или спиртов сахаров или карбоновых кислот, а добавление спиртов сахаров или дисахаридов к водным растворам фактора VIII с целью увеличения стабильности при проведении тепловых обработок описывается в Европейском патенте 117064 (Green, Cross).

В Международном патенте WO 91/10439 (Octopharma) заявляется стабильный раствор для проведения инъекций фактора VIII или фактора IX, который содержит дисахарид, преимущественно сахарозу, и один или несколько аминокислот.

В Европейском патенте 315968 и Европейском патенте 314095 (Rorer) заявляются стабильные составы разной ионной силы, содержащие фактор VIII.

Белки отличаются по своим физико-химическим свойствам. При получении фармацевтических препаратов, которые должны быть физико-химически приемлемыми и устойчивыми в течение длительного времени следует учитывать не только физиологические свойства белка, но также и другие аспекты, такие как возможность промышленного производства, простоту в использовании пациентом и безопасность для пациента. Последствия учета всех этих факторов при тестировании различных составов трудно предсказать заранее, а потому зачастую для каждого белка возможен единственный раствор.

Фактор VIII, содержащийся в плазме, стабилизируется за счет ассоциации с белком-носителем-фактором фон Виллебранда. В плазме, а также в обычных концентратах фактора VIII промежуточной степени чистоты отношение фактора фон Виллебранда к фактору VIII составляет по крайней мере 50:1 по весу. В очень чистых концентратах фактора VIII, обладающих удельной активностью более 2000 м.е. на мг белка, отношение фактора фон Виллебранда к фактору VIII составляет около 1:1 (по весу) и в основном весь фактор VIII присоединен к фактору фон Виллебранда. Несмотря на эту стабилизацию для достижения приемлемой стабильности в процессе лиофилизации и хранения требуется дополнительная стабилизация за счет введения альбумина.

Все суперчистые препараты, поступающие в продажу, стабилизированы альбумином (альбумином сыворотки человека).

В настоящее время требуется фактор VIII для инъекций без альбумина, содержащий минимальное количество добавок.

Нами разработаны новые композиции, которые позволяют разрешить указанные проблемы для фактора VIII.

Неожиданно было обнаружено, что фактор VIII, который является очень чувствительным белком, может быть стабилизирован без альбумина добавлением неионогенного поверхностно-активного вещества.

Таким образом, изобретение относится к композиции, включающей коагулирующий фактор VIII и неионогенное поверхностно-активное вещество в качестве стабилизатора. Наш фактор VIII является высоко чистым, т.е. имеет удельную активность более 5000 ME/мг белка, а композиции стабилизированы без добавления альбумина.

Если фактор VIII является рекомбинантным, он может быть либо полноразмерным, либо делеционным производным, таких как производное SQ.

Количество фактора VIII составляет от 10 до 100000 МЕ/мл, преимущественно от 50 до 10000 МЕ/мл.

Неионогенное поверхностно-активное вещество преимущественно выбирают из блок-сополимера, такого как полиоксамер, или сложного эфира полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты, такого как полисорбат 20 или полисорбат 80. В качестве полисорбата 80 используют Tween 80.

Неионогенное поверхностно-активное вещество должно присутствовать в количестве выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ) (см. Lee, Journal of Pharm. Sci., Vol. 63, 136, 1974).

Сложный эфир полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты преимущественно содержится, таким образом, в количестве по крайней мере 0,01 мг/мл. Это количество может составлять, в частности, от 0,02 до 1 мг/мл. Композиция может также включать хлорид натрия или калия, преимущественно в количестве более, чем 0,1 М.

Композиция преимущественно содержит соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, предпочтительно в количестве не менее 0,5 мМ, и аминокислоту, такую как L-гистидин, в количестве не менее 1 мМ. Это количество может быть, например, выбрано в интервале от 0,05 до 500 мМ.

Могут быть добавлены моно- и дисахариды, такие как сахароза или спирты сахаров, в частности, в количестве от 1 до 300 мг/мл.

Композиция преимущественно содержит L-гистидин и сахарозу. Отношение в композиции хлорида натрия к L-гистидину составляет не менее 1:1.

Композиция может включать:
i) 10-100000 м.е./мл рекомбинантного фактора VIII;
ii) по крайней мере 0,01 мг/мл сложного эфира полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты;
iii) хлорид натрия, преимущественно в количестве не менее 0,1 М;
iv) соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, преимущественно в количестве не менее 0,5 мМ;
v) аминокислоту, такую как L-гистидин, в количестве не менее 1 мМ.

К этой композиции преимущественно добавляют моно- или дисахариды или спирты сахаров.

Композиция может быть в твердой форме, преимущественно лиофилизованной, или в виде водного раствора до или после сушки. Высушенный продукт разбавляют стерильной водой для инъекции или буферным раствором.

Заявляемая композиция может быть также готовым к употреблению стабильным водным раствором.

Изобретение относится также к композициям, в которых удельная активность r-VIII SQ составляет более 12000 м.е./мг белка, преимущественно более 14000 м.е./мг.

Заявляемая композиция может быть получена путем смешивания фактора VIII с неионогенным поверхностно-активным веществом в водном растворе, преимущественно вместе с аминокислотой, такой как L-гистидин, натриевой солью, сахарозой и кальциевой солью или путем элюированием фактора VIII на последнем этапе очистки буфером, содержащим в водном растворе неионогенное поверхностно-активное вещество, преимущественно вместе с аминокислотой, такой как L-гистидин, натриевую соль, сахарозу и кальциевую соль.

Изобретение относится также к использованию в качестве стабилизатора композиции, включающей коагуляционный фактор VIII, неионогенного поверхностно-активного вещества, которое преимущественно выбирают из блок-сополимера, предпочтительно полиоксамера или сложного эфира полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты, преимущественно полисорбата 20 или полисорбата 80.

Аминокислота используется в системе в качестве буфера, а также для защиты белка в аморфной фазе. Подходящим буфером может служить L-гистидин, лизин и/или аргинин. В основном используют L-гистидин, поскольку он обладает хорошими буферными свойствами при значениях pH около 7.

Для защиты белка можно также добавлять сахарозу или спирт сахара.

Кальций (или ионы двухвалентного металла), в данном случае в виде хлорида кальция, хотя могут добавляться и другие соли, такие как глюконат кальция, глюбионат кальция или глюцептат кальция, необходим для связывания большей и меньшей цепочек фактора VIII.

Представленные в примерах данные показывают, что r-VIII SQ при хранении при температуре 5±3^oC устойчив в течение по крайней мере 12 месяцев.

Следующие примеры поясняют изобретение и содержат данные о стабильности различных составов, каждый из которых подпадает под объем притязаний по изобретению и которые не ограничиваются указанными примерами.

На фиг. 1 приведены данные, полученные методом гель-проникающей хроматографии с использованием жидкостной хроматографии высокого давления, полученные для примера 10A после его хранения в течение 5 месяцев при температуре 25^oC.

На фиг. 2 - данные, полученные методом гель-проникающей хроматографии с использованием жидкостной хроматографии высокого давления, полученные для примера 10B после его хранения в течение 5 месяцев при температуре 30^oC.

Получение рекомбинантного фактора VIII SQ (r-VIII SQ) проводят в основном по методике, приведенной в патенте WO 91/09122 в примере 1-3. D HFR дефицитный целин яйцеклеток китайского хомяка DG44N. Y. ) наносят методом электрополировки с вектором экспрессии, содержащим ген r-VIII SQ, и вектором экспрессии, содержащим ген дигидрофолят-редуктазы. Путем постепенного увеличения содержания метотрексата проводят последовательный отбор выживающих колоний из выбранной среды. Жидкость над осадком полученных колоний подвергают индивидуальному скринингу на VIII:C активность. Выбирают клон для продуцирования, который затем подготавливают для роста в не содержащей сыворотки суспензии в выбранной среде, и наконец разрабатывают полномасштабный процесс получения. Жидкость над осадком отбирают через определенные промежутки времени и подвергают дальнейшей очистке; как это описано далее.

Устанавливают необходимое значение pH осветленной и доведенной до кондиции среды и переносят ее в колонку, наполненную S-Sepharose FF. После промывки фактор VIII элюируют солевым буферным раствором, содержащим 5 мМ хлорида кальция.

Изучение иммуноадсорбции проводят на иммуноафинной смоле, лигандом в которой служит моноклональное антитело (8A4). воздействующее на длинную цепочку фактора VIII. Перед загрузкой в колонну S-элюат подвергают обработке раствором, содержащим 0,3% TNBP и 1% октоксинола 9.

Колонку приводят в равновесное состояние, промывают и фактор VIII элюируют буферным раствором, содержащим 0,05 М хлорида кальция и 50% этиленгликоля.

mAb-Элюат помещают в колонку, наполненную Q-Sepharose FF, и при проведении иммуноафинного анализа приводят в равновесное состояние элюированием буферным раствором.

После промывки фактор VIII элюируют 0,05 М раствором L-гистидина, 4 мМ раствором хлорида кальция и 0,6 мМ раствора хлорида натрия с pH 6,8.

О-элюат помещают в колонку для фильтрования (Superdex 200 p.g.). Приведение в равновесное состояние и элюирование проводят с помощью состава, содержащего хлорид натрия, L-гистидин, хлорид кальция и полисорбат 80.

Собирают фракции, содержащие белок, и готовят раствор перед проведением сублимационной сушки.

Устанавливают активность VIII: C и концентрацию неактивных компонентов путем разбавления подходящим буфером. Раствор затем стерилизуют фильтрованием (0.22 мкм), распыляют и подвергают сублимационной сушке. Образцы каждого состава замораживают и хранят при -70^oC. Эти образцы после оттаивания используют в качестве стандарта при проведении исследований VIII:C.

Коагулирующую способность VIII: C определяют по методу пигментообразующего субстрата (Coatest Factor VIII, "Chrovogenix AB", Мелндал, Швеция). Активированный фактор X (Xa) генерируется по внутреннему механизму, при этом фактор VIII:C играет роль кофактора. Затем определяют содержание фактора Xa, используя синтетический пигментообразуюищй субстрат S-2222 в присутствии ингибитора тромбина 1-2581 для предотвращения гидролиза субстрата под действием тромбина. Реакцию прерывают добавлением кислоты, а содержание VIII: C, которое пропорционально выделению п-нитроанилина, определяют фотометрически на длине волны 450 нм по отношению к чистому реагенту. Содержание фактора VIII: C выражено в международных единицах (м.е.) в соответствии с требованиями Международного стандарта по концентратам, принятого Всемирной организацией здравоохранения.

Регенерацию VIII:C вычисляют в процентах как отношение содержания VIII:C во вновь приготовленном растворе, деленного на содержание VIII:C в замороженном, а затем оттаянном растворе для процесса сублимационной сушки, предусматривающего соответствующие приспособления для разбавления.

Растворимые аггрегаты определяют методом гель-проникающей хроматографии. Используют наполненную колонку Superdex 200 HR 13/30 (фирмы "Pharmacia") и флюоресцентный детектор (частота возбуждения 280 нм, полоса испускания 340 нм). Анализируют вновь приготовленные составы. Оценку результатов гель-проникающей хроматографии проводят визуальным изучением хроматограмм или интегрированием площадей пиков в том случае, когда образуются аггрегаты.

Величину регенерации в процессе сублимационной сушки выражают в процентах по отношению к замороженным стандартным образцам.

Пример 1. Сравнение альбумина и неионогенного поверхностно-активного вещества
Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиций представлен в табл. 1
Приведенный пример показывает, что не наблюдается различий в регенерации фактора VIII : C при использовании неионогенного поверхностно-активного вещества или альбумина.

Пример 2. Зависимость результатов от силы неионогенного поверхностно-активного вещества.

Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 2 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиции представлен в табл. 2.

Нетрудно заметить, что удивительно высокое стабилизирующее воздействие оказывает добавление неионогенного поверхностно-активного вещества.

Пример 3. Изменение концентрации поверхностно-активного вещества
Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиций представлен в табл. 3.

Результаты, приведенные в этом примере, показывают, что регенерация фактора VIII (VII : C) была очень высокой после повторного растворения и хорошей для всех использованных концентраций полисорбата 80.

Пример 4. Изменение концентрации хлорида натрия.

Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах в течение до 6 месяцев, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиций представлен в табл. 4.

Растворы с содержанием 0,3 или 0,6 М хлорида натрия показывают очень хорошую стабильность. Оба состава устойчивы при хранении при 37^oC в течение 6 месяцев.

Пример 5. Изменение концентрации L-гистидина
Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах в течение до 3 месяцев, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиций представлен в табл. 5.

Этот пример показывает, что различные количества L-гистидина не влияют на стабильность.

Пример 6. Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части (см. табл. 6).

Эти растворы замораживают/оттаивают 1, 5 и 10 раз и получают значения для регенерации, представленные в табл. 7.

Полученные результаты показывают, что VIII : C устойчив после повторных циклов замораживание/оттаивание и что ПЭГ-4000, который, как считается, играет роль защиты при охлаждении, не обязателен в указанных составах.

Пример 7. Изменение pH.

Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиций представлен в табл. 8.

Приведенный пример показывает, что pH не оказывает заметного воздействия в интервале значений от 6,0 до приблизительно 7,5.

Пример 8. Добавка сахарозы.

Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиций представлен в табл. 9.

Сахарозу добавляют в раствор B после стадии финишной очистки перед сублимационной сушкой.

Восстановление после сублимационной сушки составляет 76% для A и 87% для B. Та же активность наблюдается после хранения вновь полученного раствора при комнатной температуре в течение 4 ч.

Это исследование показывает, что добавка сахарозы благоприятствует регенерации VIII : C после сублимационной сушки.

Пример 9. Изменение концентрации соли кальция.

Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций.

Состав композиций представлен в табл. 10.

Представленные данные показывают, что хлорид кальция можно заменить глюконатом кальция.

Пример 10. Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек во вновь приготовленном препарате составляет около 1000 и.е. (см. табл. 11).

Регенерация хорошая и в том случае, если часть L-гистидина заменяется на сахарозу.

Указанные композиции исследуют методом гель-проникающей хроматографии после 5 месяцев хранения при температуре 25^oC и 30^oC соответственно, и полученные результаты представлены на фиг. 1 и 2. Единственными наблюдаемыми пиками является пик при 42, указывающий на присутствие фактора VIII : C, и пик при 70, который соответствует гистидину. Аггрегаты должны наблюдаться при значениях, меньших 40. Из фиг. 1 видно, что для 10A после 5 месяцев хранения аггрегаты не обнаруживаются. На фиг.2 дл 10В после 5 месяцев хранения при 30^oC наблюдается небольшое количество аггрегатов, содержание которых составляет менее 2%.

Пример 11. Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек во вновь приготовленном препарате составляет около 500 и.е. (см. табл. 12).

Оба состава показывают хорошую стабильность.

Эти составы исследовались методом гель-проникающей хроматографии и полученные результаты аналогичны приведенным на фиг. 1 и 2.

Аггрегирование не наблюдается при хранении составов в течение 5 месяцев при 25^oC и 30^oC, соответственно.

Пример 11. Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах в течение до 3 месяцев, а затем вновь растворяют в 4 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек во вновь приготовленном препарате составляет около 500 и.е. (см. табл. 13).

Удовлетворительная стабильность достигается при хранении в течение пяти месяцев при температуре 7^oC.

Пример 12. Рекомбинантный фактор VIII получают по методике, описанной в Экспериментальной части.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах вплоть до 3 месяцев, а затем вновь растворяют в 4 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек в приготовленном растворе составляет около 500 и.е. (см. табл. 14).

Удовлетворительная стабильность наблюдается после хранения при 7^oC в течение 5 месяцев.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения пациентов, болеющих гемофилией. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный фактор коагуляции VIII, в качестве стабилизатора для длительного хранения - полисорбат 80, хлорид натрия или калия, соль кальция и L-гистидин для забуферивания системы. Способ получения заявленной композиции путем смешивания фактора VIII с полисорбатом 80 и другими компонентами или хроматографической очисткой рекомбинантного фактора VIII и элюирования его на последней стадии очистки буфером, содержащим полисорбат 80. Применение полисорбата 80 в качестве стабилизатора композиции, содержащей рекомбинантный фактор коагуляции VIII. Изобретение обеспечивает получение стабильной при хранении фармацевтической композиции без добавления альбумина. 4 с. и 18 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный фактор коагуляции VIII и стабилизатор активности фактора VIII во время хранения в течение продолжительного периода времени, причем указанная композиция является либо первоначально и конечно водным раствором, готовым для применения, либо первоначально водным раствором, который затем сушат и в конце воссоздают в виде водного раствора перед применением, отличающаяся тем, что композиция содержит рекомбинантный фактор коагуляции VIII с удельной активностью более 2000 МЕ/мг белка и в количестве 10-100000 МЕ/мл, в качестве стабилизатора - полисорбат 80 в количестве по меньшей мере 0,01 мг/мл, хлорид натрия или калия в количестве более 0,1 М, соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, предпочтительно в количестве более 0,5 мМ, и L - гистидин для забуферивания системы и защиты белка в аморфной фазе. 2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что фактор VIII является высокочистым и устойчив без добавления альбумина. 3. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что фактор VIII является полноразмерным или делеционным производным рекомбинантного фактора VIII. 4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что содержание фактора VIII составляет 10-100000 МЕ/мл предпочтительно 50-10000 МЕ/мл. 5. Композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что полисорбат 80 присутствует в количестве выше критической концентрации мицеллообразования. 6. Композиция по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что содержит полисорбат 80. 7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что полисорбат 80 присутствует в количестве не менее 0,01 мг/мл. 8. Композиция по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что содержит хлорид натрия или калия, преимущественно в количестве более 0,1 М. 9. Композиция по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что содержит соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, преимущественно в количестве более 0,5 мМ. 10. Композиция по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что содержит аминокислоту, такую как L-гистидин, в количестве более 1 мМ. 11. Композиция по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что содержит моно- или дисахариды, преимущественно сахарозу или спирты сахаров. 12. Композиция по любому из пп. 10 и 11, отличающаяся тем, что содержит L-гистидин и сахарозу. 13. Композиция по пп. 8 и 10, отличающаяся тем, что отношение хлорида натрия к L-гистидину составляет более 1:1. 14. Композиция по любому из пп. 1-13, отличающаяся тем, что включает:
10-100000 МЕ/мл рекомбинатного фактора VIII; по меньшей мере 0,01 мг/мл полисорбата 80; хлорид натрия, преимущественно в количестве более 0,1 М; соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, преимущественно в количестве более 0,5 мМ; аминокислоту, такую как L-гистидин, в количестве более 1 мМ. 15. Композиция по любому из пп. 1-14, отличающаяся тем, что ее высушивают. 16. Композиция по любому из пп. 1-14, отличающаяся тем, что ее подвергают лиофилизации. 17. Композиция по любому из пп. 1-14, отличающаяся тем, что является стабильным водным раствором, готовым к употреблению. 18. Композиция по любому из пп. 3-17, отличающаяся тем, что удельная активность r-VIII SQ составляет более 12000 МЕ/мг, преимущественно более 14000 МЕ/мг. 19. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что удельная активность фактора VIII составляет более 5000 МЕ/мг белка. 20. Способ получения композиции по п. 1, отличающийся тем, что проводят смешение фактора VIII с полисорбатом 80 в водном растворе, причем указанный раствор дополнительно содержит хлорид натрия или калия, соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, и L-гистидин. 21. Способ получения композиции по п. 1, отличающийся тем, что включает очистку рекомбинантного фактора VIII, полученного ферментацией, в хроматографической последовательности, содержащей, по меньшей мере, две стадии, выбранные из стадий катионообменной хроматографии, стадий анионообменной хроматографии, стадий иммуноаффинной хроматографии и стадий гель-фильтрации, с последующим элюированием фактора VIII из последней стадии очистки с помощью буфера, содержащего полисорбат 80 в водном растворе, причем указанный раствор дополнительно содержит хлорид натрия или калия, соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, и L-гистидин. 22. Применение полисорбата 80 в качестве стабилизатора композиции, содержащей рекомбинантный фактор коагуляции VIII.

Приоритет по пунктам:
02.10.92 по пп.1-9, 11-13, 15-17, 19-21;
01.10.93 по пп. 10, 14, 18, 22;
11.06.93 по п.18.