ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ N-(6-МЕТИЛ-2,4-ДИОКСО-1,2,3,4-ТЕТРАГИДРО-5H-ПИРИМИДИНСУЛЬФОН)-N'- ИЗОНИКОТИНОИЛГИДРАЗИДА, ПРОЯВЛЯЮЩАЯ АНТИМИКРОБНУЮ И ИММУНОТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ, И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ЕЕ ОСНОВЕ Российский патент 2002 года по МПК A61K31/505 

Изобретение относится к области биологически активных веществ, в частности к динатриевой соли N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида (изодинафон), проявляющей антимикробную и иммунотропную активность, и к лекарственному средству на ее основе.

Известен N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразид гидрат (изофон) (патент РФ 2141322), обладающий антимикробными и антимикобактериальными свойствами, однако в силу плохой растворимости в воде он имеет невысокую биологическую активность, что подтверждается экспериментом на животных (кроликах), в котором показано, что около 50% изофона в неизмененном виде обнаруживается в продуктах жизнедеятельности.

Также известен диуцифон, обладающий иммуномодулирующими свойствами и оказывающий иммуностимулирующее действие на гуморальный и клеточный иммунитет (авторское свидетельство СССР 459228), однако он не обладает собственной митогенной активностью, а способен увеличивать пролиферацию Т-клеток только в ответ на фитогемагглютинин (ФГА). Токсичность диуцифона 2600 мг/кг.

Целью изобретения является создание нового вещества, обладающего антимикробной и иммунотропной активностями, и лекарственного средства на его основе.

Поставленная цель достигается предложенной динатриевой солью N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида формулы I:

проявляющей антимикробную и иммунотропную активность.

Поставленная цель также достигается предложенным лекарственным средством, обладающим антимикробной и иммунотропной активностью, содержащим активное вещество, отличие которого состоит в том, что в качестве активного вещества оно содержит динатриевую соль N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон) -N'-изоникотиноилгидразида в количестве от 0,01 до 2 г.

Желательно лекарственное средство использовать в виде капсул, таблеток, инъекций и мазей.

Предложенное соединение получают путем взаимодействия эквимолярных количеств изофона и едкого натра в воде с последующим осаждением продукта реакции этанолом.

Биологические испытания изодинафона показали, что его действие на гуморальный иммунитет при приеме внутрь сравнимо с действием изофона и диуцифона растворимого, тогда как при парентеральном введении такой же эффект достигается при введении в 5 раз меньших доз изодинафона.

Также в 3 раза меньшие дозы изодинафона, чем диуцифона растворимого активируют пролиферацию Т-лимфоцитов и повышают фагоцитарную активность макрофагов. Иммунокорригирующая способность изодинафона в 2 раза превосходит такую же у изофона.

Все вышесказанное позволяет сократить количество применяемых лекарственных средств, сделав тем самым лечение менее дорогим.

Совершенно неожиданно изодинафон, в отличие от изофона, показал антимикробную активность, в случае с В. cereus - бактерицидную, а в случае с St. aureus - бактериостатическую.

Кроме того, заявленное вещество проявляет противотуберкулезную и противолепрозную активность.

Токсичность изодинафона была определена на белых беспородных мышах весом 18-20 г в остром опыте по методу Литчфильда-Уилкоксона и составила более 7000 мг/кг.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения динатриевой соли N'-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида.

2 г (6,2 ммоль) изофона растворяют в 13 мл раствора, содержащего 0,52 г (13 ммоль) едкого натра. Полученный слегка желтоватый раствор фильтруют через стеклянный фильтр и фильтрат переносят в трехгорлую колбу. Охлаждают до комнатной температуры и при интенсивном перемешивании приливают 60 мл этанола. Перемешивают 2 часа до полного осаждения соли. Осадок отфильтровывают, промывают 20 мл спирта, сушат в сушильном шкафу при 50^oС.

Выход 1,7 г (74,2%). Белый аморфный порошок, т. пл. 300^oС, очень хорошо растворим в воде.

Заявленное соединение было испытано в экспериментах на животных.

Пример 2
Определение иммунотропной активности изодинафона.

а) Влияние на гуморальный иммунитет изучали с помощью метода локального гемолиза в геле. Мышей гибридов F1 (СВА х C₅₇BI₆) иммунизировали эритроцитами барана в дозе 5 х 10⁶ и сразу после этого вводили изучаемые вещества как перорально в крахмальной суспензии, так и парентерально. На 5-е сутки подсчитывали количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и определяли индекс стимуляции иммунного ответа по отношению числа АОК в опытной группе к числу АОК в контрольной группе.

Данные представлены в таблице 1.

Индексы стимуляции иммунного ответа изофона, диуцифона растворимого и изодинафона при введении препаратов внутрь достоверно неразличимы между собой. Это говорит о том, что исследуемые препараты обладают одинаковым действием на гуморальный иммунитет, тестируемый в реакции накопления АОК в селезенке мышей.

Предлагаемый препарат изодинафон действует и при парентеральном введении в меньшей дозе, что позволяет экономить препарат. Действует он в такой же степени, что и диуцифон растворимый, но при этом преимущество изодинафона в его меньшей токсичности по сравнению с диуцифоном растворимым как при введении перорально, так и при введении парентерально (ЛД₅₀ изодинафона при пероральном введении 7000 мг/кг, а диуцифона растворимого 2600 мг/кг (2136-3042); при парентеральном способе введения ЛД₆₀ изодинафона 1750 мг/кг (1286-2380), а диуцифона 1100 мг/кг (887-1364)).

б) Влияние исследуемых препаратов на пролиферацию Т-лимфоцитов изучали на модели in vitro. Для этого проводили предварительную 3-часовую инкубацию мононуклеарных клеток человека в присутствии различных концентраций каждого исследуемого вещества. Изучали широкий диапазон концентраций каждого исследуемого вещества: от 0,01 до 5 мкг/л. В качестве негативного контроля добавляли физиологический раствор 0,9% NaCl.

Результаты влияния новых соединений на интенсивность пролиферации Т-лимфоцитов человека в культуре клеток in vitro представлены в таблице 2.

Таким образом, предлагаемый препарат так же как и изофон обладает как собственной митогенной активностью, так и в ответ на фитогемагглютинин, но проявляет эту активность при добавлении в меньшей дозе.

в) Влияние исследуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов изучали по клиренсу туши в крови, взятой из ретроорбитального синуса мышей, получавших препараты перорально. Результаты оценивали по фагоцитарному индексу (таблица 3).

Результаты, приведенные в таблице, говорят о том, что изодинафон стимулирует фагоцитарную активность макрофагов так же как и диуцифон растворимый при любом способе введения, но в большей степени при введении пероральном, тогда как изофон действует только при пероральном введении.

г) Иммунокорригирующая способность изодинафона была определена на модели иммунодефицита, вызванного облучением мышей F₁ (CBA x C₅₇BI₆) в дозе 4 Грэя. Показано, что облучение мышей в дозе 4 Грэя уменьшает иммунный ответ в 15-20 раз, его восстановление начинается на 6-8 сутки и заканчивается к 30 суткам (Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф., Филатов П.П. Действие ионизирующей радиации на соотношение популяций лимфоидных клеток у мышей. Радиобиология, 1976 г., т. 16, 3, стр. 451-454). При использовании этой модели подопытным животным вводили испытуемые препараты в дозах 500 мкг/мышь перорально в 0,5 мл крахмальной суспензии и 100 мкг/мышь парентерально в 0,2 мл физраствора. Препараты вводили трижды на 6, 7, 8 сутки после облучения. Контрольная группа животных получала 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора. На 15 сутки у этих животных определяли количество АОК в селезенке методом локального гемолиза в геле.

Полученные данные представлены в таблице 4.

На основании полученных данных по восстановлению иммунного ответа после облучения можно сделать вывод, что изодинафон проявляет иммунокорригирующую активность, не уступающую препаратам сравнения при введении перорально и в 2 раза превосходящую изофон при введении парентерально в дозе, в 5 раз меньшей.

Пример 3
Определение противотуберкулезной активности изодинафона.

Активность проверялась в сравнении с изофоном и высокоактивным иммуномодулятором диуцифоном растворимым. Для заражения использовались лабораторные штаммы микобактерий туберкулеза H₃₇ RV обычный и тубазидоустойчивый до 100 мг. 230 мышей линии СВА заражали внутривенно 0,25 мг культуры микробактерий туберкулеза в 0,5 мл физраствора. Опыт продолжался 2 месяца с 10 сентября по 12 ноября 1996 г. Под наблюдением находилось 16 групп животных по 15 мышей в каждой группе, все животные содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе. Контрольные группы получали в течение всего опыта через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора парентерально. Опытные группы животных получали препараты перорально в различных дозах в 0,5 мл крахмальной суспензии или в 0,2 мл физраствора парентерально. Все животные, как павшие, так и забитые, по окончании опыта взвешивались, также взвешивались их внутренние органы, определялась степень поражения внутренних органов, оцениваемая в "+", кроме этого о действии препарата судили по средней продолжительности жизни (СПЖ).

Результаты экспериментов приведены в таблице 5.

Как показывают полученные результаты, изодинафон обладает выраженным противотуберкулезным действием как на микобактерии, чувствительные к большинству противотуберкулезных препаратов, так и на микобактерии, резистентные к тубазиду. Судя по индексу поражения легких, зараженных животных, леченных изодинафоном и диуцифоном растворимым, противотуберкулезная активность изодинафона проявляется при парентеральном введении в большей степени, чем у препаратов сравнения.

Пример 4
Определение противолепрозной активности изодинафона в сравнении с изофоном и диуцифоном растворимым.

Противолепрозная активность изодинафона в сравнении с изофоном и диуцифоном растворимым изучалась на мышах самцах линии СВА, зараженных лабораторным штаммом Кур-4 микобактерии лепры, взятыми в количестве 5000 и введенными интраплантарно по методу Шепарда. Опыт продолжался 6 месяцев с 7 февраля по 4 августа 1996 г. Под наблюдением находилось 5 групп по 20 мышей в каждой группе. Все мыши содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе.

Первая группа - контрольная: в течение 6 месяцев мыши этой группы получали через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии. В другой серии опытов контрольным животным парентерально в исследуемые сроки вводили 0,2 мл физраствора, а опытным - препараты, разведенные в физрастворе.

Через 6 месяцев животные были забиты цервикальным смещением позвоночника, органы были подвергнуты бактериоскопическому исследованию, никаких патологических отклонений, характерных для какой-либо группы, не обнаружено. При бактериоскопическом исследовании места заражения (лапку) растирали в 2 мл 0,1% раствора альбумина, из 0,01 мл суспензии делали мазок, окрашивали по Цилю-Нильсену и подсчитывали количество микобактерий на 1 мышь в каждой группе.

Результаты исследований представлены в таблице 6.

Как следует из приведенных данных, изодинафон во всех исследуемых дозах и способах применения проявляет выраженную противолепрозную активность в отличие от диуцифона растворимого и изофона, не обладающих противолепрозной активностью в дозе 25 мкг/мышь.

Пример 5
Изучение антимикробного действия изодинафона.

Антимикробное действие изодинафона в сравнении с диуцифоном растворимым и изофоном исследовалось на культурах Bacillus cereus и Slaphylococcus aureus. Для определения антимикробного действия препаратов на В. cereus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в 10 мл фосфатного буфера (рН 7,0) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие 1 мл расплавленной среды 1 (Государственная Фармакопея СССР, изд-е XI, вып.1, т. 2, стр. 200) и 1 мл суточной бульонной культуры В. cereus, разведенной в 1000 раз физраствором. Содержимое пробирки сразу выливали на чашку Петри, содержащую 15 мл застывшей среды 1, чашки ставили в термостат при температуре от 30 до 35^oС.

Для определения антимикробного действия препаратов на Si. aureus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в среде 8 (Государственная Фармакопея СССР, изд. Xl, вып. 1, т.2, стр. 208) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие по 4 мл расплавленной среды 10 (Государственная Фармакопея СССР, изд. Хl, вып. 1, т.2, стр. 208) и 1 мл суточной бульонной культуры Staphylococcus aureus, разведенной физраствором в 1000 раз. Содержимое пробки сразу же выливали в чашки Петри, содержащие 15 мл застывшей среды 10, чашки ставили в термостат с температурой от 30 до 35^oС. Эксперимент длился 5 суток.

В случае отсутствия роста тест-штаммов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие препаратов. Результаты эксперимента представлены в таблице 7.

Как показывают результаты проведенных экспериментов, изодинафон обладает бактерицидным действием на микроорганизмы В. cereus и выраженным бактериостатическим действием на St. aureus в отличие от изофона, не обладающего антимикробным действием, и от диуцифона растворимого, обладающего слабым бактериостатическим действием.

Примеры рецептур лекарственного средства представлены ниже.

Инъекции:
активное начало изодинафон - 200 мг,
растворитель - новокаин 0,5% или 0,25% - 5 мл.

Капсулы:
активное начало изодинафон - 100 мг, 200 мг, 500 мг.

Таблетки:
активное начало изодинафон - 200 мг,
наполнители:
крахмал - 30 мг,
тальк - 10 мг,
лактоза - 10 мг.

Мазь:
активное начало изодинафон - 2 г,
основа:
воск эмульсионный - 20 г,
вазелиновое масло - 20 г,
глицерин - 20 г,
вода дистиллированная - 38 г.

Соединение формулы I, а также лекарственное средство на его основе, могут быть использованы в качестве иммуномодулятора при хронических рецидивирующих болезнях, осложненных бактериальными инфекциями на фоне иммунодефицита.

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию новых лекарственных средств. Представленное соединение формулы I

проявляет антимикробную и иммунотропную активность. Лекарственное средство на его основе может быть выполнено в виде желатиновых капсул, таблеток, инъекций. Технический результат: лекарственное средство может быть использовано при хронических рецидивирующих болезнях, осложненных бактериальными инфекциями на фоне иммунодефицита. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 7 табл.

1. Динатриевая соль М-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида формулы I

проявляющая антимикробную и иммунотропную активность. 2. Лекарственное средство, обладающее антимикробной и иммунотропной активностью, содержащее активное вещество, отличающееся тем, что в качестве активного вещества оно содержит динатриевую соль М-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноил-гидразида по п.1 в количестве от 0,01 до 2 г. 3. Лекарственное средство по п.2, отличающееся тем, что оно выполнено в виде желатиновых капсул, таблеток, инъекций.