6-АЛКИЛ-5-(2-ИЗОНИКОТИНОИЛСУЛЬФОГИДРАЗОИЛ)УРАЦИЛГИДРОХЛОРИД И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2005 года по МПК C07D401/12 A61K31/513 A61P31/06 A61P37/02 A61P31/08 

Изобретение относится к области биологическиактивных веществ, в частности к 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлоридам, которые обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью и могут быть использованы в качестве иммуномодулятора и антимикобактериальных средств, а также к фармацевтической композиции на их основе.

Известны щелочные соли N-(6-алкил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида формулы (А) (Изодинафон)

где R является алкилом с 1-4 атомами углерода и М является щелочным металлом, обладающие аналогичной активностью с токсичностью 7000 мг/кг (см. международную заявку на патент WO 01/32650). Однако их активность не достаточно высока (см. нижеследующие таблицы).

Известен также N-(6-метил-2.4-диоксо-1.2.3.4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N-изоникотиноилгидразид гидрат (В), обладающий антимикобактериальной и иммуномодулирующей активностями (патент RU 2141322). Однако данное соединение (В) не растворяется в воде, физрастворе и других растворителях, имеет плохую растворимость в биологических жидкостях, что свидетельствуют о его низкой биологической активности, невысокой биодоступности.

В основу изобретения положена задача - изыскание новых близких по структуре соединений, обладающих более высокой активностью.

Задача решается предложенными 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфо-гидразоил)урацилгидрохлоридами общей формулы (I)

где R является алкилом с 1-4 атомами углерода.

6-Метил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид формулы (I) представляют собой мелкокристаллический порошок от белого до кремового цвета с температурой плавления Тпл= 253-254°С.

Предложенные соединения получают путем взаимодействия гидразида изоникотиновой кислоты с 6-метилурацил-5-сульфохлоридом в растворителе.

Соединения формулы (I) обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью.

Задача также решается предложенной фармацевтической композицией, обладающей антимикобактериальной и иммунотропной активностью, включающей активное вещество и целевые добавки, отличие которой состоит в том, что в качестве активного вещества она содержит 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I) в эффективном количестве.

Дозировка зависит от возраста, состояния и веса пациента, а также от вида введения. Согласно изобретению, предлагаемая фармацевтическая композиция содержит активного вещества в количестве от 0,1 до 4 г.

Токсичность предложенных соединений была определена на белых беспородных мышах весом 18-20 г в остром опыте по методу Литчфильда-Уилкоксона и составила более 7000 мг/кг.

Заявленные соединения были испытаны в экспериментах на животных.

Определение иммунотропной активности предложенного гидрохлорида

а) Влияние на гуморальный иммунитет изучали с помощью метода локального гемолиза в геле. Мышей гибридов F1 (СВА × С₅₇BI₆) иммунизировали эритроцитами барана в дозе 5×10⁶ и сразу после этого вводили изучаемые вещества как перорально в крахмальной суспензии, так и парентерально. На 5-е сутки подсчитывали количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и определяли индекс стимуляции иммунного ответа по отношению число АОК в опытной группе к числу АОК в контрольной группе.

Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Влияние исследуемых соединений на накопление антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме).Название препаратаСпособ введенияДоза м кг/мышьКоличество АОК в селезенкеКол-во животныхИндекс стимуляции иммунного ответаКонтрольперорально0,5 мл крахм. суспензии500±50121,0Гидрохлоридперорально5002850±150125,3±0,5Изодинафонперорально5002360±250124,6±0,7Контрольпарентерально0,2 мл физиол. раствора510±50121,0Гидрохлоридпарентерально1001800±10012403±0,6Изодинафонпарентерально1001650±280123,20±0,6

Индексы стимуляции иммунного ответа гидрохлорида и изодинафона при введении препаратов внутрь достоверно неразличимы между собой. Это говорит о том, что исследуемые препараты обладают близким действием на гуморальный иммунитет, тестируемый в реакции накопления АОК в селезенке мышей.

б) Влияние исследуемых препаратов на пролиферацию Т-лимфоцитов изучали на модели in vitro. Для этого проводили предварительную 3-х часовую инкубацию мононуклеарных клеток человека в присутствии различных концентраций каждого исследуемого вещества. Изучали широкий диапазон концентраций каждого исследуемого вещества: от 0,01 до 5 мкг/л. В качестве негативного контроля добавляли физиологический раствор 0,9% NaCI.

Результаты влияния новых соединений на интенсивность пролиферации Т-лимфоцитов человека в культуре клеток in vitro представлены в таблице 2.

Таблица 2.
Влияние гидрохлорида на пролиферацию Т-лимфоцитов в культуре in vitro.ПрепаратДоза, мкг/млИнтенсивность включения 3Н-тимидинов ДНК культивируемых клеток (импульс/мин)СпонтаннаяАктивированная ФГАФизраствор 80020002Гидрохлорид590020132 1127525400 0,1130138000 0,03198031150 0,01153029990Изодинафон562019142 181222068 0,1114428145 0,03176234284 0,01149629586

Таким образом, предлагаемый гидрохлорид также как и изодинафон обладает как собственной митогенной активностью, так и в ответ на фитогемагглютинин, но проявляет эту активность при добавлении в меньшей дозе.

в) Влияние исследуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов изучали по клиренсу туши в крови, взятой из ретроорбитального синуса мышей, получавших препараты перорально. Результаты оценивали по фагоцитарному индексу (таблица 3).

Таблица 3.
Влияние исследуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме).ПрепаратСпособ введенияДоза, мкг/мышьФагоцитарный индексКол-во животныхКрахмальная сусп.перорально0,5 мл4,2±0,0612Гидрохлоридперорально5007,1±0,0312Изодинафонперорально5006,64±0,1212Физрастворпарентерал.0,2 мл4,1±0,0712Гидрохлоридпарентерал.1007,5±0,0612Изодинафонпарентерал.1007,12±0,0912

Результаты, приведенные в таблице, говорят о том, что гидрохлорид стимулирует фагоцитарную активность макрофагов в большей степени, чем изодинафон при любом способе введения.

г) Иммунокорригирующая способность гидрохлорида была определена на модели иммунодефицита, вызванного облучением мышей F₁ (СВА х С₅₇BI₆) в дозе 4 Грэя.

Показано, что облучение мышей в дозе 4 Грэя уменьшает иммунный ответ в 15-20 раз, его восстановление начинается на 6-8 сутки и заканчивается к 30 суткам (Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф., Филатов П.П. Действие ионизирующей радиации на соотношение популяций лимфоидных клеток у мышей, Радиобиология, 1976 г., т. 16, №3, стр. 451-454). При использовании этой модели подопытным животным вводили испытуемые препараты в дозах 500 мкг/мышь перорально в 0,5 мл крахмальной суспензии и 100 мкг/мышь парентерально в 0,2 мл физраствора. Препараты вводили трижды на 6,7,8 сутки после облучения. Контрольная группа животных получала 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора. На 15 сутки у этих животных определяли количество АОК в селезенке методом локального гемолиза в геле.

Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4.
Влияние гидрохлорида на восстановление процесса формирования антителообразующих клеток селезенки у облученных животных.ПрепаратСпособ введенияДозы мкг/мышьКол-во животныхАОК на селезенкуИндекс стимуляцииОблученный контроль  12309±36 ГидрохлоридПерорально500121080±393,5±0,4ИзодинафонПерорально50012995±123,2±0,5Контроль физ. растворПарентерально0,2 мл12312±40 ГидрохлоридПарентерально100121200±544,0±0,2ИзодинафонПарентерально100121074±12 83,5±0,5

На основании полученных данных по восстановлению иммунного ответа после облучения можно сделать вывод, что гидрохлорид проявляет большую иммунокорригирующую активность чем у препаратов сравнения.

Определение противотуберкулезной активности гидрохлорида.

Активность проверялась в сравнении с изодинафоном. Для заражения использовались лабораторные штаммы микобактерий туберкулеза Н₃₇RV обычный и тубазидоустойчивый до 100 мг. 230 мышей линии СВА заражали внутривенно 0,25 мг культуры микробактерий туберкулеза в 0,5 мл физраствора. Опыт продолжался 2 месяца. Под наблюдением находилось 20 групп животных по 15 мышей в каждой группе, все животные содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе. Контрольные группы получали в течение всего опыта через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора парентерально. Опытные группы животных получали препараты перорально в различных дозах в 0,5 мл крахмальной суспензии или в 0,2 мл физраствора парентерально. Все животные, как павшие, так и забитые, по окончании опыта взвешивались, также взвешивались их внутренние органы, определялась степень поражения внутренних органов, оцениваемая в «+», кроме этого о действии препарата судили по средней продолжительности жизни (СПЖ).

Результаты экспериментов приведены в таблице 5.

Таблица 5.
Влияние исследуемых веществ на противотуберкулезную активность.Препараты, дозы, способ введенияН₃₇RVH₃₇RV-тубазидоустойчивостьСПЖ, суткиВес легкого, мгИндекс пораженияСПЖ, суткиВес легкого, мгИндекс пораженияКонтроль 0,5 мл крах.24,2619,22,4823,8632,42,42суспензии перорально±2,7±50,4±0,22±0,22±70,2±0,19Гидрохлорид 1003,5500±10537,3450,51,7мкг/мышь перорально±5,051,2±0,13±3,8±51,7±0,2Изодинафон 10033,4526,12,0132,4492,81,96мкг/мышь перорально±5,1±47,2±0,12±3,5±63,4±0,21Контроль 0,2 мл22,8628,32,5224,1648,22,72физраствора парентерально±2,2±61,4±0,21±4,0±71,4±0,21Гидрохлорид31,25301,733,4590,31,950 мкг/мышь парентерально±2,1±21,5±0,03±3,2±75,5±0,1Изодинафон30,5580,2±1,8031,6607,82,0350 мкг/мышь парентерально±4,646,2±0,09*±3,1±59,2±0,21** Величины, достоверно отличающиеся от контроля, Р<0,05

Вышеизложенные результаты показывают, гидрохлорид обладает выраженным противотуберкулезным действием как на микобактерии, чувствительные к большинству противотуберкулезных препаратов, так и на микобактерии, резистентные к тубазиду. Судя по индексу поражения легких, зараженных животных, противотуберкулезная активность гидрохлорида проявляется в большей степени, чем у препаратов сравнения.

Определение противолепрозной активности гидрохлорида в сравнении с изодинафоном.

Противолепрозная активность гидрохлорида в сравнении с изодинафоном изучалась на мышах самцах линии СВА, зараженных лабораторным штаммом Кур-4 микобактерии лепры, взятыми в количестве 5000 и введенными интраплантарно по методу Шепарда. Опыт продолжался 6 месяцев. Под наблюдением находилось 5 групп по 20 мышей в каждой группе. Все мыши содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе.

Первая группа - контрольная: в течение 6 месяцев мыши этой группы получали через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии. В другой серии опытов контрольным животным парентерально в исследуемые сроки вводили 0,2 мл физраствора, а опытным - препараты, разведенные в физрастворе.

Через 6 месяцев животные были забиты цервикальным смещением позвоночника, органы были подвергнуты бактериоскопическому исследованию, никаких патологических отклонений, характерных для какой-либо группы, не обнаружено. При бактериоскопическом исследовании места заражения (лапку) растирали в 2 мл 0,1% раствора альбумина, из 0,01 мл суспензии делали мазок, окрашивали по Цилю-Нильсену и подсчитывали количество микобактерий на 1 мышь в каждой группе.

Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6.
Влияние исследуемых веществ на противолепрозную активность (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме).ГруппаДоза мкг/мышьКол-во мышей в группеКол-во микобактерий в лапке х10⁶% инфицированных животныхКонтроль0,5 мл крах. сусп. перор.201,14±0,12100Гидрохлорид5020-0Изодинафон5020-0Контроль0,2 мл физраствора парентерально201,27±0,14100Гидрохлорид2520-0Изодинафон2520-0

Как следует из приведенных данных, гидрохлорид во всех исследуемых дозах и способах применения проявляет выраженную противолепрозную активность так же, как и изодинафон в дозе 25 мкг/мышь.

Изучение антимикробного действия гидрохлорида

Антимикробное действие гидрохлорида в сравнении с изодинафоном исследовалось на культурах Bacillus cereus и Staphylococcus aureus. Для определения антимикробного действия препаратов на В. cereus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в 10 мл фосфатного буфера (рН 7,0) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие 1 мл расплавленной среды №1 (Государственная Фармакопея СССР, изд-е XI, вып.1, т.2, стр.200) и 1 мл суточной бульонной культуры В. cereus, разведенной в 1000 раз физ-раствором. Содержимое пробирки сразу выливали на чашку Петри, содержащую 15 мл застывшей среды №1, чашки ставили в термостат при температуре от 30 до 35°С.

Для определения антимикробного действия препаратов на St. aureus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в среде №8 (Государственная Фармакопея СССР, изд.XI, вып.1, т.2, стр.208) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие по 4 мл расплавленной среды №10 (Государственная Фармакопея СССР, изд.XI, вып.1, т.2, стр.208) и 1 мл суточной бульонной культуры Staphylococcus aureus, разведенной физраствором в 1000 раз. Содержимое пробки сразу же выливали в чашки Петри, содержащие 15 мл застывшей среды №10, чашки ставили в термостат с температурой от 30 до 35°С. Эксперимент длился 5 суток.

В случае отсутствия роста тест-штаммов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие препаратов. Результаты эксперимента представлены в таблице 7.

Таблица 7.
Антимикробное действие гидрохлорида в сравнении с изоди-нафоном.Тест-культураГидрохлоридИзодинафон 24ч.48ч.5 сут.24ч.48ч.5 сут.S. cereus------St. aureus-----±

+ - наличие роста микроорганизмов

- - отсутствие роста микроорганизмов

± - незначительный рост микроорганизмов

Как показывают результаты проведенных экспериментов, гидрохлорид обладает бактерицидным действием на микроорганизмы В. cereus и выраженным бактериостатическим действием на St. aureus.

Способ получения предложенных соединений формулы (I) иллюстрируется следующим примером.

Пример

Смешивают 1,26 г (0,01 моль) гидразида изоникотиновой кислоты и 2,245 г (0,01 моль) 6-метилурацил-5-сульфохлорида в ацетонитриле при температуре кипения растворителя в течение 5 часов.

Фильтруют, выпавший в осадок гидрохлорид и очищают в несколько стадий следующим образом: 0,5 г гидрохлорида кипятят в 15 мл спирта в течение 10 минут, далее фильтруют, промывают осадок 6 мл спирта, сушат на воздухе. Так повторяют еще один или два раз до момента, когда останутся только следовые количества примесей.

Получают 3,115 г 6-метил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацил-гидрохлорида (примерно выход 90%), который представляет собой мелкокристаллический порошок от белого до кремового цвета. Т_пл= 253-254°С

Примеры рецептур фармацевтических композиций

Капсулы

Гидрохлорид в желатиновых капсулах по 0,1 г и по 0,2 г получают фасованием ручным способом в капсулы №1 и №0 с помощью капсульниц с запорным устройством. Состав: гидрохлорид - 0,1 г и 0,2 г без наполнителей и консервантов.

Навеску гидрохлорида 10,0 г помещают на пластину капсульницы, распределяют по поверхности пластины и далее в соответствии с описанием процесса работы с капсульницей.

Желатиновые капсулы состоят из: хинолина эпу - 0,05%, титана диоксида-1,0%, желатина - до 100%. Входящие в состав капсул вещества разрешены к медицинскому применению в России.

Таблетки

Активное вещество - соединение формулы (I) в количестве 100 мг, 200 мг - массовая часть 40%. Целевые добавки (лактоза, аэросил, стеарат кальция) - массовая часть 60%.

Смешивают основное и вспомогательные вещества в соотношениях, указанных в таблице 8 (расчет на массу таблетки):

Таблица 8Масса таблетки (М_т), гМассовый состав, %0,2500,500Гидрохлорид - 0,1гидрохлорид - 0,240Лактоза - 0,144Лактоза - 0,28857,6Аэросил - 0,004Аэросил - 0,0081,6Стеарат Са - 0,002Стеарат Са - 0,0040,8

Диаметр шаров - 5 мм. Масса шаров на 100г готовой формы - 500 г.

Прессование таблеток осуществляют на прессе РТМ-12. На таблетки наносят покрытие на основе ацетилфталилцеллюлозы (АФЦ) на аппарате "Strea-1". Состав покрытия (массовые части): ацетон - 56,4; этиловый спирт 96% - 37,6; касторовое масло - 1,0; АФЦ - 5,0; тропеолин - добавляют до светло-коричневой окраски раствора. Расход покрытия: количество покрытия (мл) = 50% от массы таблеток (г).

Раствор для инъекции

Гидрохлорид для инъекций представляет собой рассыпку порошка лекарственного средства, включающее активное вещество и его фармацевтически приемлемые соли в дозировке 0,1-0,5 г.

Конкретные составы указаны в таблице 9.

Таблица 9СоставляющиеКоличество, мл123соединение формулы (I), г0,10,20,5РастворительПриемлемый растворитель5^- Приемлемый растворитель^-5 Приемлемый растворитель  5

Эксперимент на животных (кроликах) показал, что около 50% этого соединения в неизменном видеобнаруживается в продуктах их жизнедеятельности. Биологические же испытания гидрохлорида (I) показали, что его действие на гуморральный иммунитет при приеме перорально незначительно выше, чем у соединения (В), тогда как при парентеральном введении одинаковый эффект достигается при введении в 8 раз меньших доз гидрохлорида.

Гидрохлорид по сравнению с вышеуказанным соединением (В) показал антимикробную активность, в случае с В. cereus - бактерицидную, а в случае с St. aureus - бактериостатическую, о чем свидетельствуют данные таблицы 10.

Изобретение относится к новым 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацил гидрохлоридам общей формулы (I), где R является алкилом с 1-4 атомами углерода, которые обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью и могут быть использованы в качестве иммуномодулятора и антимикобактериальных средств. Изобретение также относится к фармацевтической композиции на их основе. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 10 табл.

1. 6-Алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I)

где R является алкилом с 1-4 атомами углерода.