СПОСОБ АЛЛЕРГОДИАГНОСТИКИ ГЛПС (ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ) ПОКАЗАТЕЛЕМ ПОВРЕЖДАЕМОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ (ППН) Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергодиагностике ГЛПС.

Известны способы аллергодиагностики с помощью показателя повреждаемости нейтрофилов при многих инфекционных заболеваниях бактериальной и вирусной этиологии (Гаврилов В.А., 1971; Фрадкин В.А. 1975, 1985) и др. Самым близким техническим решением является (1). Аллергены для теста ППН.

Выпускается ряд наименований препаратов для диагностики путем постановки теста ППН. Тест заключается в оценке амебиодной активности нейтрофилов крови больных, которую рассматривают как начальную фазу их повреждения. При инкубации крови высокосенсибилизированных лиц в смеси со специфическим аллергеном реакция нейтрофилов заметно усиливается.

Для этого исследования требуются две порции крови по 0,08 мл каждая (при необходимости использования 2 аллергенов берут 3 порции крови). Кровь, взятую микропипеткой из места прокола кожи, переносят в опытную и контрольную пробирку. Перед этим на дно опытной пробирки вносят 0,02 мл аллергена в смеси с антикоагулянтом (0,8 мл аллергена с 0,2 мл 25% раствора цитрата натрия). Контрольная пробирка должна содержать 0,02 мл 5% раствора цитрата натрия. В течение 2 ч кровь инкубируют при 38^oC, затем из каждой пробирки готовят мазки. После подсыхания их фокусируют, а затем подвергают гистохимической обработке. С целью обнаружения внутриклеточого гликогена (по Шабадашу) ядро лейкоцитов докрашивают гематоксилином. Эти операции выполняют в соответствии с методическими указаниями, прилагаемыми к каждой коробке с аллергеном.

Оценивают реакцию по результатам микроскопии и иммерсионной системой 100 нейтрофилов. При подсчете клетки делят на две категории - нормальные и поврежденные (в состоянии амебоидной активности).

Результат диагностики выражают формулой

где 1 - число обнаруженных поврежденных нейтрофилов в опытном мазке, 2 - аналогичное число в контрольном препарате. При правильно проведенном контроле число поврежденных нейтрофилов не превышает 10%. У здоровых несенсибилизированных людей выраженность ППН при внесении в кровь аллергенов не превышает индекса 0,1.

Целью данного изобретения является сокращение времени лабораторных исследований.

Указанная цель достигается применением известного способа аллергодиагностики с помощью показателя повреждаемости нейтрофилов /ППН/ впервые при ГЛПС /геморрагической лихорадке с почечным синдромом/.

Способ осуществляется следующим образом.

Под наблюдением находилось 10 больных ГЛПС в возрасте от 18 до 45 лет (все мужчины). У 2 больных ГЛПС протекала в тяжелой форме с развитием анурии и подключением гемодиализа. У 8 больных заболевание проходило в форме средней тяжести. Постановка ППН проводилась в динамике болезни /лихорадочный олигурический, полиурический и реконвалесцентный периоды/. Препарат для проведения теста ППН был приготовлен в отделе геморрагических лихорадок НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов г. Москва.

С целью регистрации /ин витро/ реактивных изменений, происходящих под влиянием аллергена /антигена/ в клетке лейкоцита, мы пользовались методикой, описанной Фрадкиным В.А. /1985/ в нашей модификации.

В микропипетку набрали кровь из пальца в количестве 0,08 мл и вносили в пробирку с 0,02 мл аллергена в смеси с антикоагулянтом (0,8 мл аллергена с 0,2 мл 25% раствора цитрата натрия). Контрольная пробирка должна содержать 0,02 мл 5% раствора цитрата натрия. Куда вносилось 0,08 мл крови. Затем в течение 2 часов кровь инкубируют при 30^oC. затем из каждой пробирки готовят мазки. После подсыхания их фиксируют, а затем красят цитохимическим методом на липиды по методу Шихена и Сторей, 1949 г.

Показатель повреждаемости нейтрофилов вычисляли по формуле

где H - количество лейкоцитов с выраженным клазматозом и лейкоцитозов в опыте, H₁ - количество таких же элементов в контроле, 100 - число сосчитанных в каждом мазке нейтрофилов.

Средняя величина ППН здоровых лиц /студенты, сотрудники больницы/ составила 0,06 ± 0,005 (контрольная группа).

У больных ГЛПС отмечалось достоверное повышение ППН. Так, в лихорадочном периоде показатель ППН составил 0,55 ± 0,02; в периоде олигоурии 0,78 ± 0,01; в периоде полиурии - 0,88 ± 0,03 и в реконвалесцентном периоде он оставался стабильным 0,85 ± 0,02, т.е. ППН при ГЛПС во все периоды болезни был достоверно выше, чем у лиц контрольной группы /P < 0,001/.

Морфологические изменения в нейтрофилах, подвергавшихся клазматозу и лейкоцитозу, характеризовались следующими этапами: изменением липидных гранул в околоядерных зонах и концентрацией их по периферии клетки с образованием наиболее насыщенных участков. Появление амебоидных выпячиваний, где липиды утрачивали свою гранулярную структуру. Помимо дегенеративных процессов в цитоплазме грубые изменения и в ядрах клетки. Подчас видны одномоментно разорванные лейкоциты /явления анафилактического шока клетки/. Деформированные и распавшиеся клетки имеют отшнурованные участки с липидными суданофильными включениями. Связь с клеткой утончается и они отшнуровываются от клетки. Протоплазма клетки при этом просветляется.

Известно, что в патогненезе инфекционного заболевания имеется сенсибилизация не только кожных покровов /см. кожные аллергические пробы /специфическим антигеном/ аллергеном /, но и интимных структур организма включая клеточный уровень. К сожалению, внутрикожная аллергическая проба при ГЛПС пока не разработана, но описанный нами способ может занять достойное место в аллергодиагностике ГЛПС, как экспрессный. На постановку ППН уходит 4 часа, а иммуноферментный 12 часов.

Источники информации:
1. Справочник по применению бактериальных и вирусных препаратов, под редакцией проф. С.Г.Дзагурова и д.м.н. Ф.Ф.Резепова, м. 1975 стр. 61.

2. Гаврилов В.А., Попов П.Н. Сравнительное изучение аллергии у больных бактериальной дизентерией реакцией повреждения лейкоцитов и внутрикожной пробой Цуверкалова. сб. Актуальные вопросы инфекционной патологии (тезисы конференции 18-20 мая 1971 года), Ставрополь 1971, стр. 106.

Использование: в медицине, а именно в аллергодиагностике. Осуществляют постановку теста показателя повреждаемости нейтрофилов (ППН). Инкубируют кровь с аллергеном. Готовят мазки. Окрашивают их цитохимическим методом на липиды. Вычисляют ППН по формуле. При значении ППН 0,55 ± 0,02 и выше диагностируют геморрагическую лихорадку с почечным синдромом. Способ обеспечивает сокращение времени лабораторной диагностики ГЛПС.

Способ аллергодиагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом путем подсчета нейтрофилов, отличающийся тем, что осуществляют постановку теста показателя повреждаемости нейтрофилов (ППН), включающего инкубацию крови с аллергеном и приготовление мазков, окрашенных цитохимическим методом на липиды, после чего вычисляют ППН по формуле
(H - Н₁)/100,
где Н - количество лейкоцитов с выраженным клазматозом и лейкоцитозом в опыте,
Н₁ - количество тех же элементов в контроле,
100 - число сосчитанных в каждом мазке нейтрофилов,
и при его значении 0,55 ± 0,02 и выше диагностируют геморрагическую лихорадку с почечным сундромом.