СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИ РЕАГИРУЮЩИХ В РЕАКЦИИ АБСОРБЦИИ-ЭЛЮЦИИ СЫВОРОТОК АНТИ-A(α), АНТИ-B(β) ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ АНТИГЕНОВ A, B В СЛЕДАХ ВЫДЕЛЕНИЙ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, именно к судебно-медицинской иммунологии и предназначено для получения специфически реагирующих в реакции абсорбции-элюции (РАЭ) изогемагглютинирующих сывороток анти-A (α), анти-B (β), применяемых для выявления антигенов A, B системы АВО в следах выделений человека.

В судебно-медицинской практике выявление антигенов A, B в следах выделений (спермы, слюны, вагинального содержимого) производится, прежде всего, в процессе выполнения судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств (например, предметов одежды) по уголовным, связанным с половыми преступлениями.

При этом наиболее чувствительной и простой в выполнении (а потому и наиболее применяемой в практической работе экспертов) иммунологической реакцией выявления антигенов A, B в следах крови и выделений в настоящее время является РАЭ.

Принцип реакции абсорбции-элюции следующий. Вначале к исследуемому пятну добавляют стандартную сыворотку и агглютинины последней абсорбируются соответствующим антигеном, находящимся в пятне (т.н. фаза абсорбции). Затем производят отмывание пятна, в процессе которого удаляются свободные неабсорбированные антитела, а на исследуемом пятне остаются только образовавшиеся в процессе абсорбции специфические комплексы антиген-антитело. На следующей стадии, в так называемой фазе элюции, производят разделение образовавшихся комплексов антиген-антитело путем нагревания; при этом происходит образование т.н. элюата - выхождение абсорбированных ранее антител в окружающую жидкую среду - строго дозированное количество физиологического раствора хлористого натрия, добавленное к нагреваемому пятну крови или выделения. Антигены A, B исследуемого пятна обнаруживают по агглютинации добавленных к элюату стандартных эритроцитов, содержащих антиген, специфичность которого соответствует специфичности антител, находящихся в полученном элюате.

Для реакции абсорбции-элюции считаются пригодными лишь сыворотки, обладающие высоким титром - 1:128 и выше.

Недавно нами была разработана модифицированная техника выполнения РАЭ при выявлении антигенов АВО в следах крови, заключающаяся в применении серологически активных протеаз на разных этапах выполнения реакции абсорбции-элюции /1/. Эта модификация позволила значительно повысить чувствительность РАЭ, следствием чего явилась возможность уверенного выявления антигенов системы АВО в меньших, чем это удается при использовании обычной техники РАЭ, количествах крови и успешного использования сывороток с более низким титром, чем это считается необходимым.

К сожалению, как показали наши исследования, применение высокоактивных протеаз при выполнении модифицированной РАЭ в случае выявления антигенов АВО в следах выделений, существенно повышая чувствительность реакции, одновременно усиливает и ее неспецифическое реагирование, проявлявшееся в усилении т. н. перекрестной реакции, а именно: антитела анти-A (α) реагировали не только с антигеном A, но и с антигеном B, а антитела анти-B (β) реагировали как с антигеном B, так и с антигеном A; наличие и выраженность этой перекрестной реакции обычно коррелировали с титром сывороток: чем выше титр, тем ярче была выраженность перекрестной реакции. Лишь отдельные сыворотки с достаточно высоким титром не обладали перекрестной реакцией, что при исследовании следов выделений с помощью модифицированной РАЭ обычно требовало тщательного предварительного подбора и контроля специфичности применяемых сывороток.

Вместе с тем, необходимо подчеркнуть, что наличие перекрестной реакции при исследовании следов выделений характерно также и для обычной техники РАЭ. Более того, наличие перекрестной реакции является самой большой, не имеющей до сих пор удовлетворительного решения проблемой применения РАЭ при выявлении антигенного полиморфизма следов выделений из-за крайнего дефицита сывороток, пригодных для решения указанной задачи.

Целью настоящего изобретения явилась разработка эффективного способа устранения неспецифического реагирования сывороток анти-A (α), анти-B (β) с антигенами противоположной специфичности при выявлении антигенов A, B в следах выделений реакцией абсорбции-элюции.

Согласно изобретению, поставленная цель достигается путем абсорбции стандартных сывороток анти-A (α), анти-B (β) пятнами слюны выделителей противоположной группы (например, сыворотки анти-A (α) пятном слюны группы В(III)), предварительно фиксированным метанолом, а затем обработанным гиалуронидазой (лидазой) и серологически активной протеазой (протеазой-C).

Для решения аналогичной проблемы И.О. Перепечина /2/ при изучении такого же перекрестного реагирования моноклональных антител анти-A, анти-B рекомендовала вместо фиксации исследуемые пятна крови и выделений обрабатывать 0,1%-ным раствором трипсина. Это снижало титр неспецифической перекрестной реакции, но не устраняло ее полностью, что совершенно необходимо при применении современных низкоактивных сывороток. Указанная работа И.О. Перепечиной /2/, а также цитировавшаяся выше работа Р.С. Сахарова и соавт. /1/ могут служить аналогами предлагаемому изобретению.

В 1975 г. Т.М.Масис, В.П.Ольховик, Г.С.Юдина /3/ для устранения перекрестного реагирования разработали модификацию РАЭ применительно к обнаружению антигенов A, B в следах выделений, основанную на замене метанольной фиксации пятен фиксацией кипячением, а также на тщательном подборе используемых сывороток.

Однако, как показали выполненные нами исследования, в случае применения модифицированной (с использованием высокоактивных протеаз) техники РАЭ, ни замена метанольной фиксации кипячением (довольно длительным и трудоемким процессом, более чем метанол, снижающим чувствительность РАЭ), ни тщательный подбор используемых сывороток, не устраняли в большинстве случаев неспецифичность результатов, получаемых в модифицированной РАЭ при исследовании следов выделений. Тем не менее, работа Т.М. Масис и соавт., /3/, как наиболее близко совпадающая с поставленной нами целью изобретения, может служить ближайшим прототипом заявляемому изобретению.

По сравнению с существующими аналогами и прототипом, предлагаемый способ получения специфически реагирующих в модифицированной и обычной РАЭ изогемагглютинирующих сывороток анти-A (α) и анти-В (β) при исследовании следов выделений, обладает следующими преимуществами:
1. Предлагаемый способ позволяет полностью устранить неспецифическое реагирование изогемагглютинирующих сывороток анти-A (α), анти-B (β) в РАЭ с антигенами противоположной специфичности пятен выделений человека.

2. Делает ненужным решение проблемы предварительного подбора сывороток, пригодных для использования в РАЭ при выявлении антигенов A, B в следах выделений; подбор сывороток является трудоемким этапом в исследовании пятен выделений; вместе с тем, как следствие неблагоприятных экологических воздействий, в настоящее время у человека наблюдается снижение уровня естественного иммунитета и, в частности, уменьшение титра естественных изогемагглютининов; уменьшилось также число кадровых доноров крови в связи с увеличением заболеваний, передающихся через кровь (гепатиты, СПИД) и боязнью населения заразиться этими болезнями в медицинских учреждениях; все это существенно ограничило количество сывороток, пригодных для использования в обычной РАЭ при судебно-медицинских исследованиях следов крови и выделений и сделало полноценный отбор сывороток практически нереальным, что, в свою очередь, обусловило выраженный дефицит сывороток, пригодных для применения в РАЭ;
3. Позволяет использовать более чувствительную, т.н. модифицированную технику РАЭ с применением высокоактивных протеаз, что дает возможность применять в РАЭ даже низкоактивные сыворотки (с титром антител 1:8 - 1:16), к тому же увеличивая их объем в 2-4 раза путем предварительного разведения перед абсорбцией; в целом это решает проблему дефицита сывороток, пригодных для РАЭ, особенно при исследовании следов выделений.

Для подтверждения эффективности и достоверности разработанного способа получения сывороток, специфически реагирующих в РАЭ, в качестве исследуемого материала были апробированы стандартные изогемагглютинирующие сыворотки анти-A (α), анти-B (β) производства СПК ГНЦ РАМН, Дзержинской СПК, по 5 серий каждой специфичности, с титром антител 1:8 - 1:128, гетероиммунные антиэритроцитарные и антислюнные сыворотки анти-A, анти-B производства ЛенВНИИВС по 3 серии каждой специфичности с титром антител 1:32 - 1:256, моноклональные антитела (цоликлоны) анти-A, анти-B производства ГНЦ РАМН, с титром антител 1:512 - 1:2048, по 2 серии каждой специфичности. Данными сыворотками типировали 20 пятен слюны (10 группы A(II), 10 - группы B(III)), 14 пятен спермы (7 - группы A(II), 7 - группы B(III)), 7 пятен вагинальных выделений (3 - группы A(II), 4 - группы B(III)). Сыворотки исследовали как в классической, так и в модифицированной РАЭ с применением протеаз. При постановке реакции абсорбции-элюции с неабсорбированными предлагаемым способом сыворотками, все они давали четкую перекрестную реакцию с антигенами противоположной специфичности до разведения 1:2 со всеми исследуемыми пятнами выделений, причем в модифицированной РАЭ (т.е. при исследовании пятен, обработанных протеазой-C специфический и неспецифический результаты были выражены ярче (таблица 1). Исключение составили моноклональные антитела анти-A, анти-B: в случае их использования в РАЭ специфический и неспецифический результаты были выражены практически одинаково, что однозначно делало эти антитела непригодными для использования в РАЭ при исследовании выделений. В случае использования в РАЭ гетероиммунных антител анти-A, анти-B, выраженность получаемых специфических результатов была заметно слабее, чем при использовании изогемагглютининов. Поэтому, все дальнейшие эксперименты по устранению перекрестного реагирования проводились только с использованием изогемагглютинирующих сывороток.

При этом мы рассматривали перекрестную реакцию как специфическое реагирование содержащихся в стандартных сыворотках дополнительных антител еще неустановленной специфичности с соответствующими им антигенами выделений.

Широко известно, что протеазы животного, микробного и растительного происхождения способны разрушать антигены ряда изосерологических систем. Однако опыты показали, что протеазы и, в частности, микробная протеаза, продуцируемая микрокультурой Aeremonium chrysogenum (протеаза-C), не разрушает нежелательные антигены выделений, а наоборот, усиливает их активность. Поэтому, мы решили включить в эксперименты использование энзимов другой специфичности - фосфоглюкомутазу и гиалуронидазу (лидазу), которые, как было показано ранее /4/, обладают серологической активностью (способностью воздействовать на мембрану эритроцитов) с неясной специфичностью. С помощью этих энзимов мы расчитывали разрушить перекрестно реагирующие антигены выделений. Однако эксперименты показали, что если фосфоглюкомутаза является при исследовании выделений серологически индифферентной (т. е. не усиливает и не ослабляет специфическую и неспецифическую активность РАЭ), то гиалуронидаза показала наличие заметной серологической активности: после обработки исследуемых пятен выделений протеазой-C и дополнительно гиалуронидазой (дидазой), наблюдается отчетливое усиление выраженности как специфической, так и неспецифической реакции. Другими словами, воздействие гиалуронидазы на выделения приводило не к разрушению, а наоборот, к дополнительному активированию антигенов, ответственных за проявление перекрестной реакции. Анализ результатов этих экспериментов привел нас к пониманию того, что искомый результат - устранение перекрестной активности РАЭ при исследовании следов выделений, может быть достигнут не разрушением нежелательных антигенов, а наоборот, их максимальным активированием в пятнах слюны (как наиболее доступных) путем обработки последних не только протеазой-C, но и гиалуронидазой (лидазой), с последующим применением этих активированных пятен для абсорбции перекрестно реагирующих антител, содержащихся в стандартных сыворотках анти-A (α) и анти-B (β). Эксперименты показали правильность этой идеи и эффективность технического решения на основе ее применения - при использовании изогемагглютинирующих сывороток в классической и модифицированной РАЭ, которые были предварительно абсорбированы по разработанному способу, перекрестная реакция полностью устранялась, а специфические антигены выделений четко выявлялись всеми десятью сериями абсорбированных сывороток анти-A (α), анти-B (β). Типичные результаты экспериментов представлены в таблице 2, необходимые технические детали разработанного и заявляемого в качестве изобретения способа, изложены в прилагаемой в Приложении "Временной инструкции по получению специфически реагирующих в РАЭ при исследовании следов выделений человека изогемагглютинирующих сывороток анти-A (α), анти-B (β) утвержденной Главным судебно-медицинским экспертом Минздрава РФ, директором Республиканского центра судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ профессором В.В.Томилиным.......... октября 1998 года.

Таким образом, проблема перекрестного реагирования сывороток в РАЭ при выявлении антигенов A, B в следах выделений является решенной.

Следует отметить, что применение гиалуронидазы (лидазы) для обработки пятен выделений с целью их последующего применения для абсорбции сывороток - вообще неизвестно и не может рассматриваться как очевидное, найденное нами техническое решение в литературе не описано и отработано в результате проведения большой серии экспериментов в соответствии с поставленной целью, т.е. предлагаемое изобретение соответствует критериям оригинальности, новизны и изобретательского уровня.

Пример практического применения предлагаемого способа получения специфических изосывороток анти-A (α) и анти-в (β).

Для приготовления специфических сывороток α,β в качестве исходного материала берут любые изогемагглютинирующие сыворотки с титром от 1:16 и выше. Обработка их новым способом состоит из приготовления рабочих растворов гиалуронидазы (лидазы) и протеазы-C, энзимирования ими фиксированных метанолом пятен слюны выделителей на марле и абсорбции этими пятнами исходных сывороток.

Для энзимирования готовят 0,2%-ный раствор коммерческого препарата протеазы-C и 0,1 -1%-ный раствор лидазы (в зависимости от активности препарата) на физиологическом растворе.

Для абсорбции сывороток используют приготовленные на стерильной марле пятна слюны выделителей группы, противоположной абсорбируемой сыворотке (например, для абсорбции сыворотки используют пятно слюны группы B(III)). Из пятен делают навески в количестве по 50 мг пятна на 4 мл сыворотки, предварительно разведенной в 2 раза. Навески фиксируют метанолом в течение 20 минут при комнатной температуре, затем высушивают на фильтровальной бумаге. После фиксации пятна обрабатывают сначала раствором лидазы в течение 45 минут в термостате с температурой 37^oC, а затем раствором протеазы-C в течение 45 минут при тех же условиях. После энзимирования пятна высушивают на фильтровальной бумаге. Далее фиксированные и энзимированные пятна помещают в соответствующие объемы исходных сывороток, разведенных в 2 раза.

Сыворотки абсорбируются в течение 18 - 20 часов в холодильнике с температурой +4 - 6^oC. После этого пятна извлекают и удаляют, сыворотки центрифугируют, отделяют от осадка в случае его наличия, затем абсорбированные сыворотки проверяют на активность и специфичность в модифицированной РАЭ. Консервируют абсорбированные сыворотки путем добавления борной кислоты в количестве 3 г на 100 мл.

Экономический эффект предлагаемого способа получения специфических сывороток анти-A (α) и анти-B (β).

Предлагаемый способ получения специфических изосывороток α и β имеет непосредственный экономический эффект, поскольку расширяет ассортимент используемых изогемагглютинирующих сывороток, пригодных для применения в РАЭ для исследования антигенов A и B в следах выделений человека.

Источники информации
1. Р. С. Сахаров, М.В. Федулова, Н.В. Гуреева и др. Применение протеаз для повышения чувствительности выявления антигенов системы АВО реакцией абсорбции-элюции в следах крови. /Суд.-мед. экспертиза, 1998, N2, с.40 - 44/
2. И. О. Перепечина. Применение моноклональных антител к групповым антигенам А, В,Н при судебно-медицинском исследовании крови и выделений человека. /Автореферат дис. канд. мед. наук, М., 1990 г./
3. Т. М. Масис ,В.П. Ольховик, Г.С. Юдина. Методические рекомендации об определении групп изосерологической системы АВО в следах слюны и спермы реакцией абсорбции-элюции с изосыворотками α и β /М., 1975 г./
4. Р. С. Сахаров. Применение протеаз в изоиммунологии и судебной медицине. /Автореферат дис. доктора мед. наук, М., 1988 г./

Изобретение относится к медицине, а именно к судебно-медицинской иммунологии и предназначено для получения специфически реагирующих в реакции абсорбции-элюции изогемагглютинирующих сывороток анти-А (α) и анти-В (β), применяемых для выявления антигенов А, В системы АВО в следах выделений человека. Сущность изобретения состоит в абсорбции изогемагглютимирующих сывороток анти-А (α), анти-В (β) предварительно фиксированными с обработанными гиалуронидазой (лидазой) и микробной протеазой пятнами слюды выделителей антигенов А, В с противоположной групповой специфичностью к используемой сыворотке. Технический результат заключается в повышении специфичности. 2 табл.

Способ получения специфически реагирующих в реакции абсорбции-элюции сывороток анти-A(α) и анти-B(β) при выявлении антигенов A, B в следах выделений человека, отличающийся тем, что осуществляют абсорбцию изогемагглютинирующих сывороток фиксированными и обработанными гиалуронидозой (лидазой) и микробной протеазой пятнами слюны выделителей антигенов A, B с противоположной групповой специфичностью к используемой сыворотке.