ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/04 A61K35/74 

Изобретение относится к иммунотерапевтическим агентам, пригодным для замедления или предотвращения роста опухолей.

Полагают, что иммунная система способна предотвращать или задерживать рост опухолей, по крайней мере в некоторых случаях, и некоторые исследования имеют тенденцию к поддержке этой точки зрения. Так, Coley (Коли) (W.B. 1894 "Treatment of Inoperable Malignant Tumours with toxins of erysipelas and the bacillus prodigiosus") описал иммунотерапевтический метод, который оказался эффективным против ограниченного круга опухолей мезодермальной природы благодаря индуцированию некротизирующего механизма, подобного тому, который индуцируется при иммунотерапии Коха против туберкулеза. С того времени большинство попыток иммунотерапии рака было нацелено на индуцирование быстрого тканевого некроза, подобного тому, который достигался в некоторых случаях Коли.

Известно, что существует по меньшей мере два типа созревания клеток Т-хелперов, называемых ТХ1 и ТХ2. Первый из них связан с выработкой интерлейкина-2 (ИЛ2), гамма-интерферона (ИНФ-γ), цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ), сниженной выработкой антител и снижением образования клеток ТХ2. Последний вырабатывает ИЛ-4, ИЛ-5, усиливает выработку антител и снижает образование клеток ТХ1. Полагают, что феномен Коха, который, возможно, индуцируется токсином Коли, является результатом смеси зрелых клеток ТХ1 + ТХ2.

Установлено, что существует две категории иммунологической реактивности, которые могут участвовать в контролировании опухолей, и обе могут вызываться вакциной Кальметта - Герена (БЦЖ). Один механизм является разрушением ткани, примером которого является иммунотерапия Коха и Коли и иммунотерапия опухолей с помощью ФНО-α (фактора некроза опухолей), и, возможно, вовлекает цитокин-опосредованное повреждение тканей в участках воспаления, полученных при опосредованном Т-клетками феномене Коха. Оказалось, что этот механизм является эффективным в отношении опухолей мезодермальной природы. Второй механизм, основанный на иммунологическом распознавании самих опухолевых клеток, может быть эффективным в отношении опухолей любой природы. Косвенным свидетельством существования основанного на ТХ1 неспецифичного противоопухолевого механизма является успешность терапии экспериментального рака рекомбинантным интерлейкином-12, мощным индуктором ТХ1.

Полагают, что Mycobacteria при использовании способом, не вызывающим индуцирования феномена Коха, может первично распознавать поврежденные аутологичные клетки через эпитопы белка температурного шока (БТШ) или эпитопы других белков с высококонсервативными последовательностями и таким путем вызывать выборочную деструкцию опухолевых клеток. Мы пришли к заключению о том, что вариабельная активность иммунотерапии БЦЖ в прошлом была результатом недопонимания того факта, что БЦЖ имеет тенденцию усиливать уже существующий иммунный ответ, что следует из экспериментов по изучению ее эффективности по защите от туберкулеза и лепры.

БЦЖ в качестве вакцины против микобактериальных заболеваний (как туберкулеза, так и лепры) является весьма вариабельной, дающей защиту от 80% до 0% по результатам различных исследований. Очень важно, следовательно, что БЦЖ, которую вводят после рождения, в целом защищает от лейкозов детского возраста только в тех географических регионах, где она защищает и от туберкулеза (Grange JM, Stanford JL, "BCG vaccination and cancer". Tubercle. 1990; 71: 61-64). Иными словами, она защищает от обоих состояний в тех местностях, где она вызывает ответ на антигены микобактерий, который не является тканево-некротизирующим и не является феноменом Коха.

Множество опухолевых клеток могут содержать на своей поверхности бактериомиметики, углеводы, антигены и эпитопы шоковых белков, а также других высококонсервативных белков в отношении классов 1 и 2 главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). В условиях большой выработки антител антитела к углеводам, естественным образом образующиеся против бактериальных сахаров, и, возможно, являются типа IgA, могут покрывать опухолевые клетки и блокировать компоненты их поверхности от клеточной иммунной атаки.

Нами было показано в международной патентной заявке PCT/GB93/00463, что иммунотерапия M. vaccae индуцирует преимущественно тип ответа ТХ1 с активизацией макрофагов посредством ИФН-γ и низкой выработкой антител. Такой ТХ1 ответ, как известно, вызывает размножение ЦТЛ. Выраженное снижение выработки антител в сочетании с возросшим количеством ЦТЛ приводит к тому, что опухолевые клетки становятся открытыми для атаки как макрофагами, активированными после того, как они присоединились к бактериомиметическим сахарам на поверхности опухолевых клеток, так и ЦТЛ, распознающими шоковый белок и другие высококонсервативные белковые эпитопы, представленные ГКГ класса 1. Полагают, что тканево-некротический механизм при феномене Коха в большой степени подавляется применением препарата, полученного из M.vaccae.

Следовательно, можно ожидать, что иммунотерапия M.vaccae будет эффективна в отношении опухолей мезодермальной, эндодермальной и эктодермальной природы, включая опухоли молочной железы и бронхов, благодаря предотвращению при задержке роста или распространения таких опухолей.

Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает применение антигенных и/или иммунорегулирующих материалов, полученных из Mycobacterium vaccae, для производства лекарственного средства, пригодного для задержки или предотвращения роста и распространения опухолей. Такие материалы могут вводиться пациенту в количестве, достаточном по меньшей мере для задержки или предотвращения роста или распространения опухолей.

Терапевтический агент настоящего изобретения предпочтительно включает в себя убитые клетки M.vaccae, более предпочтительно клетки, которые были убиты автоклавированием. Этот иммунотерапевтический агент обычно содержит более 10⁸ микроорганизмов на 1 мл разбавителя и предпочтительно от 10⁸ до 10¹¹ убитых микроорганизмов M.vaccae на 1 мл разбавителя. Настоящее изобретение включает в свой объем антигенный и/или иммунорегулирующий материал из M.vaccae для применения в терапии с целью задержки или предотвращения роста или распространения опухоли.

Разбавитель может быть апирогенным физиологическим раствором для инъекций или боратным буфером с pH 8,0. Разбавитель должен быть стерильным. Подходящим боратным буфером является следующий раствор:
Na₂B₄O₃•10H₂O - 3,63 г
H₃BO₃ - 5,25 г
NaCl - 6,19 г
Твин - 0,0005%
Дистиллированная вода - До 1 л
Предпочтительным является штамм M.vaccae, обозначенный R877R, выделенный из образцов грязи округа Ланго Центральной Уганды (J.L. Stanford & R.C.Paul, Ann. Soc. Belge Med.Trop. 1973, 53, 141-389). Этот штамм является стабильным шероховатым вариантом и может быть идентифицирован как M.vaccae по биохимическим и антигенным критериям (R.Bonicke, S.E.Juhasz, Zentr. a1b1. Bakteriol.Parasitenkd. Infection skr. Hgy.Abt. 1, Orig., 1964, 192, 133).

Штамм R877R был помещен на депозит в Национальную коллекцию типовых культур (NCTC) Центральной лаборатории здравоохранения, Colindale Avenue, London NW9 5HT, United Kingdom 13 февраля 1984 под номером NCTC 11659.

Для приготовления иммунотерапевтического агента микроорганизм M.vaccae можно выращивать на подходящей твердой среде. Предпочтительна модифицированная жидкая среда Sauton (S.V.Boyden & Sorkin., J.Immunol., 1955, 75, 15), отвержденная агаром. Предпочтительно, твердая среда содержит 1,3% агара.

Среду, инокулированную микроорганизмами, инкубируют в аэробных условиях, чтобы сделать возможным рост микроорганизмов, обычно при 32^oC в течение 10 дней. Микроорганизмы собирают, затем взвешивают и суспендируют в разбавителе. Разбавителем может быть физиологический раствор без буфера, но предпочтительно он содержит боратный буфер и поверхностно-активное вещество, такое как Твин 80, как описано выше. Суспензию разбавляют до получения концентрации 100 мг микроорганизмов на 1 мл. Для дальнейшего разбавления предпочтительно используют физиологический раствор с боратным буфером так, чтобы суспензия содержала 10 мг сырого веса микроорганизмов на 1 мл разбавителя. Эту суспензию затем можно разлить в 5 мл флаконы, содержащие множество доз. Несмотря на то что микроорганизмы во флаконах могут быть убиты излучением, например ⁶⁰кобальта в дозе 2,5 Мрад, или любыми другими средствами, например химически, предпочтительно убивать микроорганизмы автоклавированием, например при 10 фунтах/кв.дюйм в течение 10 минут (115-125^oC). Обнаружено, что при автоклавировании получается более эффективный препарат, чем при облучении.

Иммунотерапевтический агент обычно вводят внутрикожной инъекцией в объеме 0,1-0,2 мл, предпочтительно 0,1 мл. Одна доза обычно содержит от 10⁷ до 10¹⁰ убитых микроорганизмов M. vaccae. Предпочтительно вводить пациентам единичную дозу, содержащую от 10⁸ до 10¹⁰ убитых M.vaccae. Тем не менее, дозу можно повторить в зависимости от состояния пациента.

Несмотря на то что иммунотерапевтический агент обычно вводят внутрикожно, можно использовать также другие пути введения, например пероральный.

Настоящее изобретение включает в свой объем способ задержки или предотвращения роста распространения опухоли, который включает в себя введение пациенту с опухолью антигенного и/или иммунорегулирующего материала, полученного из Mycobacterium vaccae, в количестве, достаточном для провоцирования иммунного ответа, эффективного для задержки или предотвращения роста или распространения опухоли.

В объеме настоящего изобретения находится также использование более чем одного штамма M.vaccae и/или включение в терапевтический агент других микобактериальных антигенов, что может иметь определенные преимущества. Также можно включать туберкулин.

Терапевтический агент также может содержать БЦЖ (вакцину Кальметта - Герена), в частности высушенную замораживанием форму этой вакцины, для усиления его эффекта.

Терапевтический агент может содержать дополнительные ингредиенты, такие как адъюванты, консерванты, стабилизаторы и т.д. Он может выпускаться в форме стерильной жидкости для инъекций или в высушенной замораживанием стерильной форме, которую разводят перед употреблением.

M. vaccae можно использовать как таковую или в форме экстракта или фракционированной части микроорганизма для приготовления терапевтических агентов по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

M.vaccae выращивают на твердой среде, включающей в себя модифицированную среду Sauton, отвержденную 1,3% агаром. Среду инокулируют микроорганизмами и инкубируют в течение 10 дней при 32^oC, чтобы сделать возможным рост микроорганизмов. Микроорганизмы затем собирают, взвешивают и суспендируют в разбавителе для получения 100 мг микроорганизмов на мл разбавителя. Затем эту суспензию разводят физиологическим раствором с фосфатным буфером до получения суспензии, содержащей 10 мг сырого веса микроорганизмов на 1 мл разбавителя и разливают в 5 мл флаконы, содержащие много доз. Эти флаконы, содержащие живые микроорганизмы, затем автоклавируют в течение 10 минут при 10 psi для того, чтобы убить микроорганизмы и получить иммунотерапевтический агент настоящего изобретения, который можно (если это желательно) дополнительно разводить перед употреблением. Этот иммунотерапевтический агент можно вводить внутрикожной инъекцией уже описанным способом.

Пример 2.

M. vaccae вводили нескольким пациентам с опухолями. Некоторые из полученных результатов приводятся ниже:
Рак молочной железы.

1) В национальном институте гигиены и эпидемиологии в Ханое, Вьетнам, где проводится ряд исследований с применением Mycobacterium vaccae в качестве иммунотерапии, сотрудница заболела раком молочной железы с поражением подмышечных лимфоузлов. После оперативного удаления этой больной посоветовали терапию БЦЖ. Наблюдая ранее такую схему лечения на других больных, пациентка не испытывала колебаний при решении принять курс БЦЖ и потребовала терапии M. vaccae. Была введена стандартная инъекция 10⁹ убитых M.vaccae, и по меньшей мере в течение трех лет пациентка чувствует себя хорошо и не обнаруживает признаков опухоли.

2) Через несколько недель получения инъекций M.vaccae для лечения упорного питириаза у 50-летней женщины обнаружили во время рутинной маммографии припухлость в молочной железе. Биопсия показала злокачественную опухоль, которую удалили оперативно. Гистопатология показала выраженный синусовый гистиоцитоз вокруг подмышечных лимфоузлов, не содержавших опухолевых клеток. Примерно через 9 месяцев произошел рецидив питириаза, и была назначена вторая доза M.vaccae, после которой произошло почти немедленное облегчение симптомов питириаза. В течение 21 месяца после удаления опухоли признаков метастазирования не наблюдалось.

3) Женщине семидесяти с небольшим лет несколько лет назад удалили опухоль молочной железы. В анамнезе - боли в спине, связанные с артритом, в течение многих лет, по поводу которых она получила инъекцию M.vaccae при попытке облегчить это состояние. Вскоре после этого рентгенография позвоночника показала ряд поражений, которые расценили как метастазы опухоли и назначили лучевую терапию. После 8-месячной задержки больная прибыла для лучевой терапии и на повторной рентгенограмме не было обнаружено признаков метастазирования; лучевая терапия была отменена. Спустя два с половиной года, больная чувствует себя хорошо и не имеет рецидива опухоли.

4) Врач общей практики 55 лет за два дня до обращения заболела, как полагали, острым абсцессом молочной железы. Операция показала наличие очень быстро растущей раковой опухоли с наличием метастазов в подмышечных лимфоузлах. Было выполнено немедленное удаление и немедленно после выписки из стационара сделана инъекция M.vaccae. Еще две инъекции были сделаны с трехмесячными интервалами. Операционная рана зажила хорошо, и спустя один год у пациентки с риском быстрого прогрессирования заболевания нет никаких признаков метастазирования.

5) У медсестры 50 лет, которая жаловалась на боли в бедре в течение одного года, диагностировали метастазы в кости малой опухоли молочной железы. После первой инъекции M.vaccae больная почувствовала себя лучше, хорошо перенесла химиотерапию и получила вторую инъекцию M.vaccae. В настоящее время она здорова.

Опухоли легких.

1) У женщины 55 лет в октябре 1993 года развилась одышка, которая, как обнаружили, была связана с неоперарабельными опухолями легких. Полагали, что это метастазы неустановленной первичной опухоли. С согласия онколога была сделана инъекция M.vaccae и начат курс химиотерапии и лучевой терапии. Пациентка перенесла лечение с весьма немногочисленными побочными эффектами и отказалась от предложенной спустя 6 месяцев второй инъекции M.vaccae. Спустя 10 месяцев ее состояние ухудшилось, химиотерапию изменили, но прогноз пациентки был оценен как плохой. Вторую инъекцию M.vaccae сделали в начале октября 1994 года, после чего состояние пациентки улучшилось, и она получила еще две инъекции, одну в декабре 1994 года, а другую - 1 марта 1995 года. Эта пациентка не только почувствовала себя значительно лучше, но и перенесла 20 курсов химиотерапии без каких-либо неудобств.

Другие злокачественные новообразования.

1) Дантисту 30 лет с терминальным заболеванием вследствие злокачественной тератомы сделали инъекцию M.vaccae непосредственно перед выпиской его домой. Пациент обнаружил признаки улучшения через 1-2 дня и спустя 3 недели обнаружил сокращение размеров видимых опухолей; пациент снова начал принимать пищу впервые за несколько недель.

2) У женщины 36 лет развилась аденокарцинома желудка вокруг язвы, полученной в результате инфицирования Helicobacter pylori. Несмотря на проведенную химиотерапию, у нее обнаружили многочисленные распространенные метастазы. Она получила первую инъекцию M.vaccae, и лечащие врачи намерены продолжать инъекции с 2-месячными интервалами.

Опухоли, связанные с ВИЧ.

1) Пациент в ранней стадии СПИДа с множественной саркомой Капоши получил инъекцию M.vaccae в ноябре 1993 года. У него больше опухоли не появлялись, а существующие опухоли обнаружили признаки рассасывания. Вторую инъекцию M. vaccae сделали в декабре 1994 года после того, как у пациента развились вторичные инфекции, связанные с ВИЧ. Ему назначили повторные инъекции M.vaccae каждые 2 месяца.

2) Пациенту, почти не имевшему CD4+ клеток, но без видимых признаков СПИДа, сделали инъекцию M.vaccae в июне 1994 года, а спустя несколько недель обнаружили на одном бедре небольшие саркомы Капоши около 0,5 см в диаметре. Дальнейшие инъекции M. vaccae делали с 2-месячными интервалами, и в марте 1995 года у пациента не было других поражений и увеличения размера начальных поражений.

3) Мужчине 48 лет с множественными рецидивирующими раковыми опухолями ротоглотки сделали инъекцию M.vaccae в июне 1994 года, а дальнейшие инъекции делали с 2-месячными интервалами. По март 1995 года признаки рецидива опухолей не наблюдались.

Случаи, приведенные выше, свидетельствуют в пользу лечения опухолей с помощью M. vaccae. Применение M.vaccae не было связано с какими-либо неблагоприятными побочными эффектами, помогло уменьшить токсические эффекты химиотерапии по меньшей мере у двух пациентов. Эти ранние практические наблюдения свидетельствуют в пользу теоретических ожиданий и обеспечивают первые свидетельства ценной противоопухолевой активности.

Пример 3.

Был проведен предварительный эксперимент с использованием мышей Balb/c, зараженных штаммом MM3 мышиной карциномы молочной железы.

Три группы по 10 мышей заражали 10⁷ клеток MM3. Спустя одну неделю первой группе инъецировали 10⁷ M.vaccae, вторая группа получила 10⁹ M.vaccae, а третья группа служила контролем. Животных умерщвляли спустя 40 дней после заражения и исследовали развитие опухолей (см. таблицу).

Изобретение предназначено для использования в онкологии для задержки или предотвращения роста или распространения опухолей. Иммунотерапевтический препарат представляет собой антигенный и/или иммунорегуляторный материал, полученный из Mycobacterium vaccae. Ранее препарат применяли для иммунотерапии туберкулеза, лепры и ряда аутоиммунных болезней, например ревматоидного артрита. Изобретение позволит повысить эффективность иммунотерапии опухолей мезодермальной, эндодермальной и эктодермальной природы, включая опухоли молочной железы и бронхов. 5 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Применение антигенного и/или иммунорегулирующего материала, полученного из Mycobacterium vaccae, при лечении опухолей для замедления или предотвращения роста или распространения опухолей. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что антигенный и/или иммунорегулирующий материал, полученный из M. vaccae, включает убитые клетки M. vaccae. 3. Применение по п.2, отличающееся тем, что клетки M. vaccae убиты автоклавированием. 4. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что материал, полученный из M. vaccae, получают из штамма, депонированного в Национальной коллекции типовых культур (N CTC) Центральной лаборатории здравоохранения, Colindale Avenue, London NW9, 5 HT, United Kingdom 13 февраля 1984 под номером N CTC 11659. 5. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что материал, полученный из M. vaccae, содержится в лекарственном средстве в количестве от 10⁷ до 10¹⁰ микроорганизмов на дозу. 6. Применение по любому из предыдущих пп, отличающееся тем, что опухоль является опухолью молочной железы или бронхов.