Изобретение относится к области биотехнологии, оно может быть использовано в области медицинской и клинической биохимии, фармацевтической промышленности, молекулярной фармакологии, в экологической диагностике, а также в области биосенсорики и нанотехнологии.
Молекулярное конструирование на основе нуклеиновых кислот (НК), т.е. направленное создание сложных трехмерных конструкций, "строительными блоками" которых являются молекулы НК, вызывает все больший интерес исследователей [D.Bethell, D.J.Schiffrin, Nature, 1996, vol. 382, p. 581; R.F.Service, Science, 1997, vol. 277, p. 1036]. Сама возможность применения НК для создания молекулярных конструкций с регулируемыми параметрами учитывает ряд свойств, характерных только для этих молекул:
а) короткие спиральные молекулы двухцепочечной НК, имеющие длину порядка 500 A0, это молекулы, имеющие высокую локальную жесткость при нормальных свойствах растворителя, что позволяет использовать такие молекулы в качестве "строительных блоков" без нарушения их свойств;
б) гибкая одноцепочечная НК не только "узнает" комплементарную ей другую цепочку, но и образует с ней прочный комплекс, что приводит к изменению пространственной структуры одноцепочечной НК и к созданию жесткой двухцепочечной молекулы;
в) искусственное введение в состав молекул НК "липких концов" позволяет "ветвить" формируемые конструкции;
г) в случае жестких молекул НК можно предсказывать и заранее программировать характер межмолекулярного взаимодействия в разных условиях, что открывает возможность для регуляции свойств создаваемых пространственных конструкций;
д) в пространственных конструкциях НК азотистые основания сохраняют способность не только к взаимодействию с разными химическими и биологически активными веществами, но и способность к их специфической ориентации относительно длинной оси молекулы НК, что придает конструкции новую химическую реакционную способность.
Интерес к молекулярным конструкциям (МОЛКОН) на основе НК обусловлен двумя практически важными обстоятельствами:
1) такие конструкции использованы в биосенсорике [J.J.Storhoff, R.Elghanian, R. C. Mucic, C.A.Mirkin, R.L.Letsinger, J. Am. Chem. Soc, 1998, vol. 120, p. 1959],
2) такие трехмерные конструкции могут быть использованы в наноэлектронике [N.C.Seeman, Acc. Chem. Res., 1997, vol. 30, p. 357].
В настоящее время известны два типа МОЛКОН, в которых в качестве "строительных блоков" использованы нуклеиновые кислоты.
Известен тип МОЛКОН [N.C.Seeman, Acc. Chem. Res., 1997, vol. 30, p. 357] , где в качестве "строительных блоков" использованы жесткие двухцепочечные молекулы НК, имеющие в своей структуре "липкие" концы и палиндромные последовательности. Пользуясь такими молекулами НК, можно создавать МОЛКОН, имеющие вид октаэдра, додекаэдра и т.д., ребрами жесткости которых являются молекулы НК. Такие МОЛКОН могут найти применение как в наноэлектронике [E. Winfree, in "DNA based Computers", 1996, R.J.Lipton, E.B.Baum, Eds, Am. Mathem, Soc., Providence, p. 199], так и биосенсорике.
Известен также другой тип МОЛКОН [R.Elghanian, J.J.Storhoff, R.C.Mucic, R. L.Leitsinger, C.A.Mirkin, Science, 1997, vol. 277, p. 1078; J.J.Storhoff, R. Elghanian, R.C.Mucic, C.A.Mirkin, R.L.Letsinger, J. Am. Chem. Soc., 1998, vol. 120, p. 1959], где в качестве "строительных блоков" использованы молекулы гибких одноцепочечных НК (НК-1), "пришитые" за счет химической реакции к частицам коллоидного золота. При взаимодействии исходной одноцепочечной НК с чужеродной НК (НК-2) в растворе происходит реакция гибридизации и возникает макроскопическая трехмерная МОЛКОН, состоящая из беспорядочно расположенных в пространстве молекул двухцепочечной (НК-1 - НК-2) гибридной НК и части золота. Такая МОЛКОН, свойства которой зависят от длины молекул НК и размера частиц коллоидного золота, может использоваться в биосенсорике в качестве биодатчика [J.J.Storhoff, R.Elghanian, R.C.Mucic, C.A.Mirkin, R.L.Letsinger, J. Am. Chem. Soc. , 1998, vol. 120, p. 1959] для определения только чужеродной НК.
Недостатками рассмотренного типа МОЛКОН, основанного на использовании изотропных растворов НК, которые ограничивают их потенциальное использование в качестве биодатчиков, являются следующие:
1) ограниченный набор (по сравнению с исходными) новых физико-химических свойств, в частности, отсутствие аномальной оптической активности, которая является наиболее эффективным критерием [патент РФ N 2107280, Бюл. N 8, 20.03.98], позволяющим следить за изменением свойств молекул НК при действии на эти молекулы биологически активных или химических соединений;
2) сложность однозначного предсказания свойств МОЛКОН, связанная с недостаточно изученными механизмами сложных химических реакций, необходимых для их создания;
3) недостаточная стабильность МОЛКОН, которая представляет собой дисперсию, агрегирующую со временем, что приводит к образованию макроскопической фазы и изменению во времени исходных физико-химических свойств МОЛКОН;
4) недостаточная чувствительность МОЛКОН к действию различных биологически активных или химических соединений, обусловленная наличием в их составе только одного "строительного блока", а именно НК.
Отмеченные выше недостатки, обусловленные тем, что основу МОЛКОН составляют молекулы НК, пространственные свойства которых не скоррелированы, существенно ограничивают возможность применения МОЛКОН в качестве биодатчиков широкого спектра действия в медицине, экологии и биотехнологии.
Известен способ [патент РФ 2032895, Бюл. N 10, 10.04.95] упорядочения двухцепочечных НК, заключающийся в том, что в водно-солевом растворе нейтрального полимера инициируют фазовое исключение жестких молекул НК низкой мол. массы, приводящее к образованию лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии.
Недостаток этого способа состоит в том, что он не дает возможности пространственно фиксировать соседние близкорасположенные молекулы НК, некоторые диффузионные степени свободы которых только ограничиваются, но не запрещаются полностью.
В основу предлагаемого изобретения положена задача разработки молекулярной конструкции и такого способа ее создания, который позволил бы, чтобы молекулярная конструкция была стабильной, с предсказуемыми и регулируемыми свойствами, с расширенным интервалом условий существования, позволяющая многократно усиливать генерируемый оптический сигнал, что позволит использовать молекулярную конструкцию в качестве интегрального биодатчика, т.е. биодатчика широкого спектра действия, меняющего свои свойства при наличии в анализируемой среде биологически значимых соединений, опасных, независимо от их природы, для здоровья человека и животных.
Поставленная задача решена созданием МОЛКОН, содержащей в своем составе в качестве "строительных блоков" молекулы двухцепочечной НК, при этом, согласно изобретению, МОЛКОН в качестве "строительных блоков" содержит ионы комплексообразующего металла, антибиотики, образующие комплексы с НК таким образом, что реакционноспособные группы антибиотиков становятся доступными для химической реакции с ионами металла, полимерные хелатные "сшивки" [антибиотик-ион металла-антибиотик-ион металла - ... - ион металл-антибиотик-ион металла антибиотик], и представляющей собой ансамбль из жестких двухцепочечных молекул НК, упорядоченных в пространстве за счет образования частиц лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии, причем взаимное положение молекул НК в пространстве зафиксировано за счет полимерных хелатных "сшивок".
Наличие в МОЛКОН разных по своей химической природе "строительных блоков", свойства которых меняются при действии на них разных химических или биологически активных соединений, в сочетании с сохранением легко детектируемой аномальной оптической активности, присущей холестерической жидкокристаллической структуре [Yu, M. Yevdokimov, S.G.Skuridin, V.I.Salyanov, 1988, Liquid Crystals, vol. 3, p. 1443], открывает возможность применения предлагаемой МОЛКОН в качестве интегрального биодатчика, т.е. биодатчика, оптические свойства которого могут меняться, в частности, при действии тяжелых металлов, восстановителей, белков и т.д., а также факторов, нарушающих целостность вторичной структуры НК.
При этом, вместо молекул НК, в качестве "строительных блоков" можно использовать любые жесткоцепные полимеры, которые образуют холестерические жидкокристаллические дисперсии и структура которых позволяет осуществлять реакции комплексообразования.
Желательно, в качестве "строительного блока" использовать молекулы линейной двухцепочечной НК низкой молекулярной массы или двухцепочечных синтетических полинуклеотидов, поскольку эти полимеры не только образуют холестерические жидкокристаллические дисперсии при фазовом исключении, но и препараты которых полно охарактеризованы, доступны и относительно дешевы.
В качестве другого "строительного блока" могут быть использованы любые соединения, имеющие планарную ароматическую структуру, которые не только способны встраиваться между парами азотистых оснований НК, но в составе которых имеются, как минимум, четыре химические группы, способные к образованию хелатных комплексов.
Целесообразно, в качестве такого "строительного блока" использовать антибиотики антрациклиновой группы, молекулы которых не только встраиваются между парами оснований НК, но и располагаются на поверхности НК таким образом, что атомы кислорода в положениях 5, 6, 11 и 12 их планарных структур становятся доступными для реакции хелатообразования.
Для "сшивки" соседних молекул НК, связанных в комплексе с антибиотиками, можно использовать ионы любых металлов, способных к образованию плоских полимерных хелатных комплексов.
Желательно, в качестве ионов, способных к образованию "сшивок" между молекулами НК, использовать ионы двухвалентной меди, которые в силу особенностей свой электронной структуры образуют плоские полимерные хелатные комплексы с антрациклиновыми антибиотиками.
Можно для создания полимерных хелатных "сшивок" между молекулами НК использовать любые химические или биологически активные соединения, способные к образованию таких "сшивок", содержащие в своей структуре элементы, разрушаемые под действием факторов внешней среды (УФ-, рентгеновское излучение и т.п.).
Поставленная задача решена также способом создания МОЛКОН путем формирования лиотропной жидкокристаллической дисперсии НК водно-солевом растворе нейтрального полимера, в котором, согласно изобретению, к лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии НК добавляют раствор антибиотика до образования комплекса [НК-антибиотик], в котором реакционноспособные группы антибиотика доступны для реакции хелатообразования, обрабатывают полученную дисперсию комплекса [НК-антибиотик] раствором соли металла, образующего плоские координационные комплексы как с молекулами антибиотика в составе комплекса [НК-антибиотик], так и со свободными молекулами антибиотика в растворе, что приводит к образованию плоской полимерной хелатной "сшивки" между соседними молекулами НК.
Способ создания МОЛКОН осуществляют в несколько стадий:
1) формирование лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии НК в водно-солевом растворе нейтрального полимера,
2) добавление раствора антибиотика до образования комплекса антибиотика с молекулами НК, в котором химические группы доступны для реакции хелатообразования,
3) добавление соли металла, способного к образованию хелатных комплексов для создания полимерных хелатных мостиков [антибиотик-ион металла- антибиотик-ион металла - ... - ион металла-антибиотик- ион металла антибиотик], "сшивающих" соседние молекулы НК, что приводит к фиксации в пространстве упорядоченных молекул НК, их стабилизации и образованию трехмерного ансамбля, сохраняющего аномальные оптические свойства, присущие холестерической структуре.
Предлагаемый способ создания МОЛКОН и ее использование в качестве интегрального биодатчика осуществляют следующим образом:
- формируют в водно-солевом растворе нейтрального полимера литропную холестерическую жидкокристаллическую дисперсию линейных двухцепочечных НК низкой молекулярной массы;
- к полученной лиотропной жидкокристаллической дисперсии добавляют раствор антрациклинового антибиотика до образования комплекса [НК - антибиотик];
- измеряют аномальную оптическую активность полученного образца на двух длинах волн, одна из которых находится в области поглощения азотистых оснований НК, другая - в полосе поглощения антибиотика;
- обрабатывают полученную жидкокристаллическую дисперсию комплекса [НК - антибиотик] раствором соли металла, способного к образованию плоского координационного комплекса с антибиотиком;
- измеряют аномальную оптическую активность полученного образца на двух длинах волн, одна из которых находится в области поглощения азотистых оснований НК и служит внутренним контролем, другая - в полосе поглощения антибиотика;
- измеряют величину аномальной оптической активности в полосе поглощения антибиотика; многократное увеличение этой полосы служит доказательством образования МОЛКОН, содержащей молекулы двухцепочечной НК, молекулы антибиотика и ионы металла;
- добавляют химические или биологически активные вещества, способные тем или иным способом нарушить целостность полимерной хелатной "сшивки" хотя бы в одном месте, и по уменьшению амплитуды аномальной полосы в спектре кругового дихроизма, пользуясь предварительно построенной калибровочной прямой, определяют наличие названных веществ.
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены примеры, характеризующие стадии изготовления МОЛКОН, со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых:
Фиг. 1 характеризует обобщенную структурную формулу антибиотиков антрациклинового ряда, использованных в работе.
Фиг. 2 характеризует спектр кругового дихроизма жидкокристаллической дисперсии линейных двуцхцепочечных молекул ДНК в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля в координатах "Δ A = (AL - AR) -λ- длина волны (нм)";
где:
Δ A - круговой дихроизм (мм); 1 мм = 1•10-5 опт.единиц;
ДНК эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия); мол. масса ДНК (0,3 - 0,6) • 106 Да; CДНК = 5,5 мкг/мл;
полиэтиленгликоль (ПЭГ, "Serva", мол.масса 4000); CПЭГ = 170 мг/мл;
0,3 М NaCl + 0,002 М фосфатный буфер, pH ≈ 6,7.
Фиг. 3 характеризует спектр кругового дихроизма жидкокристаллической дисперсии молекул ДНК, связанных в комплексе с дауномицином (ДАУ), в координатах "Δ A = (AL - AR) -λ- длина волны (нм)";
CДНК = 5,5 мкг/мл; CПЭГ = 170 мг/мл;
0,3 М NaCl + 0,002 М фосфатный буфер, pH ≈ 6,7;
CДАУ = 16,4•10-6 М;
Фиг. 4 характеризует спектр кругового дихроизма жидкокристаллической дисперсии комплекса [ДНК-ДАУ], которая обработана раствором хлорида двухвалентной меди, в координатах "Δ A = (AL - AR) -λ- длина волны (нм)";
CДНК = 5,5 мкг/мл; CПЭГ = 170 мг/мл;
0,3 М NaCl + 0,002 М фосфатный буфер, pH ≈ 6,7;
CДАУ = 16,4•10-6 М; 
= 5•10-6 М.
Фиг. 5 показывает обобщенную структуру полимерной хелатной "сшивки" между двумя соседними молекулами ДНК (вид вдоль длинной оси молекул ДНК).
Фиг. 6 характеризует спектр кругового дихроизма МОЛКОН на основе ДНК, в которой в качестве "сшивающего" агента использован аналог дауномицина - адриамицин (АДР), в координатах "Δ A = (AL - AR) -λ- длина волны (нм)";
ДНК эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия); мол. масса ДНК ≈ (0,3 - 0,6) • 106 Да;
CДНК = 5,5 мкг/мл; CПЭГ = 170 мг/мл;
0,3 М NaCl + 0,002 М фосфатный буфер, pH ≈ 6,7.
CАДР = 14,3•10-6 М; 
= 5•10-6 М.
Фиг. 7 характеризует вид частиц МОЛКОН, созданной на основе жидкокристаллической дисперсии ДНК, иммобилизованных на трековой мембране (ядерном фильтре), полученный при помощи атомного силового микроскопа.
CДНК = 3 мкг/мл; CПЭГ = 17 мг/мл;
CДАУ = 7,2•10-6 М; 
= 1,9•10-6 М.
Фиг. 8 характеризует распределение частиц МОЛКОН по размеру, полученное путем прямого измерения 113 частиц.
Фиг. 9 представляет гипотетическую пространственную структуру МОЛКОН на основе жидкокристаллической дисперсии ДНК.
Фиг. 10 характеризует спектры кругового дихроизма МОЛКОН на основе ДНК до (кривая 1) и после ее обработки БСА в течение 10 и 60 мин (кривая 2 и 3, соответственно) в координатах: "Δ A = (AL - AR) -λ- длина волны (нм)";
На фиг. 10 указаны обозначения величины кругового дихроизма в разные моменты (T) обработки молекулярной конструкции БСА, где:
Δ AМАКС - максимальная амплитуда полосы в спектре КД МОЛКОН в отсутствие БСА;
Δ A (T) - амплитуда полосы в спектре КД МОЛКОН при фиксированном времени (T) обработки БСА;
Δ A - круговой дихроизм (мм); 1 мм = 1•10-6 опт. единиц;
CДНК = 0,69 мкг/мл; CПЭГ = 21,25 мг/мл;
CДАУ = 2,05•10-6 М; 
= 0,74•10-6 М; CБСА = 5,7 мкг/мл.
Фиг. 11 характеризует зависимость изменения относительной амплитуды (ΔΔA = ΔAмакс-ΔA/ΔAмакс) полосы в спектре КД λ = 505 нм) МОЛКОН от времени (T) ее обработки БСА в координатах: "ΔΔA - T - мин";
CДНК = 0,69 мкг/мл; CПЭГ = 21,25 мг/мл;
CДАУ = 2,05•10-6 М; 
= 0,74•10-6 М;
кривая 1 - CБСА = 1,1 мкг/мл; кривая 2 - CБСА = 3,4 мкг/мл; кривая 3 - CБСА = 5,7 мкг/мл;
Фиг. 12 характеризует зависимость относительной амплитуды полосы в спектре КД (λ = 505 нм) МОЛКОН от концентрации БСА в координатах: "ΔΔ A - CБСА - мкг/мл".
На фиг. 12, в качестве примера, приведены зависимости, соответствующие 10 и 60 мин обработки молекулярной конструкции БСА (прямые 1 и 2, соответственно);
CДНК = 0,69 мкг/мл; CПЭГ = 21,25 мг/мл;
CДАУ = 2,05•10-6 М; 
= 0,74•10-6 М.
Фиг. 13 характеризует спектры кругового дихроизма МОЛКОН на основе ДНК (кривая 1) после ее обработки суммарным белком (10 и 60 мин, кривые 2 и 3, соответственно) в координатах: "Δ A = (AL - AR) -λ- длина волны, нм";
CДНК = 0,69 мкг/мл; CПЭГ = 21,25 мг/мл;
CДАУ = 2,05•10-6 М; 
= 0,74•10-6 М; CБЕЛКА = 5,5 мкг/мл.
Фиг. 14 характеризует зависимость изменения относительной амплитуды полосы (ΔΔA = ΔAмакс-ΔA/ΔAмакс) в спектре КД (λ = 505 нм) МОЛКОН от времени ее обработки суммарным белком в координатах: "ΔΔ A - T - мин";
CДНК = 0,69 мкг/мл; CПЭГ = 21,25 мг/мл;
CДАУ = 2,05•10-6 М; 
= 0,74•10-6 М;
кривая 1 - CБЕЛКА = 1,2 мкг/мл; кривая 2 - CБЕЛКА = 3,4 мкг/мл; кривая 3 - CБЕЛКА = 5,5 мкг/мл;
Фиг. 15 характеризует зависимость изменения относительной амплитуды полосы (ΔΔA = ΔAмакс-ΔA/ΔAмакс) в спектре КД (λ = 505 нм) МОЛКОН от концентрации суммарного белка в растворе в координатах: "ΔΔ A - CБЕЛКА - мкг/мл".
На фиг. 15, в качестве примера, приведена зависимость после обработки МОЛКОН суммарным белком (10 и 60 мин, прямые 1 и 2, соответственно);
CДНК = 0,69 мкг/мл; CПЭГ = 21,25 мг/мл;
CДАУ = 2,05•10-6 М; 
= 0,74•10-6 М.
Пример 1. Способ создания молекулярной конструкции на основе молекул ДНК, фиксированных в структуре жидкокристаллической дисперсии.
1.1. Приготовление жидкокристаллической дисперсии ДНК
1.1.1. Жидкокристаллическую дисперсию готовят из молекул двухцепочечной ДНК эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия; молекулярная масса ДНК ≈ (0,3 - 0,6) • 106 Да, CДНК = 5,5 мкг/мл) путем фазового исключения ДНК из водно-солевых (0,3 М NaCl) растворов полиэтиленгликоля ("Serva", мол.масса = 4000).
1.1.2. Аномальные оптические свойства жидкокристаллической дисперсии ДНК контролируют, измеряя спектр кругового дихроизма (КД) (патент РФ N 2107280, Бюл. N 8, 20.03.98). Появление интенсивной отрицательной полосы (фиг. 2) в спектре КД (λ ≈ 270 нм) свидетельствует об упорядоченном расположении соседних молекул ДНК в структуре жидкокристаллической дисперсии.
1.2. Приготовление жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК с антрациклиновым антибиотиком дауномицином (ДАУ).
1.2.1. Препарат ДАУ ("Sigma, США) растворяют при перемешивании в 1 мл дистиллированной воды.
1.2.2. К 2 мл жидкокристаллической дисперсии по 1.1 добавляют 9 мкл раствора по п. 1.2.1 (CДАУ = 3,65•10-3 М) при интенсивном перемешивании.
Таким способом получают комплекс между молекулами ДНК и ДАУ в составе жидкокристаллической дисперсии и измеряют ее спектр КД (фиг. 3).
Появление дополнительной отрицательной полосы в спектре КД в области поглощения ДАУ (λ ≈ 505 нм) свидетельствует об образовании комплекса [ДАН-ДАУ] в случае жидкокристаллической дисперсии ДНК.
1.3. Создание МОЛКОН на основе молекул ДНК.
1.3.1. Готовят 0,001 М раствор CuCl2.
1.3.2. К 2 мл жидкокристаллической дисперсии комплекса [ДНК - ДАУ] по п. 1.2 добавляют 10 мкл раствора по п. 1.3.1 при перемешивании и затем регистрируют спектр КД полученной смеси (фиг. 4). Многократное увеличение аномальной оптической активности в области поглощения ДАУ (λ ≈ 505 нм) свидетельствует о значительном увеличении концентрации анизотропно расположенных молекул ДАУ в составе жидкокристаллической дисперсии в результате образования МОЛКОН, в которой между молекулами ДНК возникают полимерные хелатные "сшивки" [ДАУ - Cu2+ - ДАУ - Cu2+ - ... Cu2+ - ДАУ - Cu2+ - ДАУ].
Таким образом получают МОЛКОН, состоящую из линейных двухцепочечных молекул ДНК, упорядоченных в пространстве и "сшитых" мостиками [ДАУ - Cu2+ - ДАУ - Cu2+ - ... - Cu2+ - ДАУ - Cu2+ - ДАУ] (фиг. 5), в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля.
Пример 2. Создание МОЛКОН на основе двухцепочечной ДНК и производных дауномицина.
Структура использованных в работе аналогов дауномицина представлена на фиг. 1.
Ниже, в качестве примера, рассмотрен случай использования адриамицина (АДР) в качестве "сшивающего" агента.
2.1. Препарат АДР ("Sigma") растворяют в 1 мл дистиллированной воды при перемешивании.
2.2. К 2 мл холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК по п. 1.1 добавляют 8 мкл раствора по п. 2.1 (CАДР = 3,6•10-3 М) при перемешивании. Таким образом получают комплекс между молекулами ДНК и АДР в составе жидкокристаллической дисперсии.
2.3. К 2 мл жидкокристаллической дисперсии комплекса [ДНК - АДР] по п. 2.2 добавляют 10 мкл раствора CuCl2 по п. 1.3.1 при перемешивании и затем регистрируют спектр кругового дихроизма (фиг. 6). Усиление оптического сигнала в спектре кругового дихроизма в области поглощения АДР свидетельствует об образовании МОЛКОН, в которой между молекулами ДНК образуются полимерные хелатные "сшивки" [АДР - Cu2+ - АДР - Cu2+ - ... - Cu2+ - АДР - Cu2+ - АДР].
Аналогичным образом формируют МОЛКОН на основе ДНК при использовании молекул 4'-дезоксидоксорубицина и 4'-дезокси-4'-иододоксорубицина в качестве "сшивающих" агентов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и воспроизводимо создавать МОЛКОН на основе молекул жидкокристаллических дисперсий двухцепочечных нуклеиновых кислот.
Пример 3. Визуализация частиц МОЛКОН.
3.1. Стабилизированные частицы МОЛКОН по п. 1.3 фильтруют через ядерный фильтр (размер пор 0,1 мкм) и высушивают на воздухе. Поверхность ядерного фильтра, на которой иммобилизованы частицы МОЛКОН, исследуют при помощи сканирующего атомного силового микроскопа "SOLVER - P47" (фирма НТ - МДТ, Зеленоград; резонансная мода; f = 546,4 кГц; площадь сканирования - 13х14 мкм, 512х512 пикселей; скорость сканирования - 280 нм/сек).
На фиг. 7 представлен вид полученных частиц. Фиг. 8 характеризует распределение частиц МОЛКОН по размеру. Размер частиц оценивали, измеряя размер и форму 113 частиц. Фиг. 7 и 8 показывают, что частицы МОЛКОН имеют сферическую форму и, хотя их размер меняется от 0,3 до 0,7 мкм, средний размер частиц составляет около 0,5 мкм.
На основании приведенных выше примеров изобретением предлагается гипотетическая структура частиц МОЛКОН (фиг. 9), как ансамбля из молекул НК, фиксированных в пространстве и стабилизированных за счет образования полимерных хелатных "сшивок", состоящих из чередующихся молекул антибиотика и ионов двухвалентной меди, между соседними молекулами НК.
Анализ структуры полимерной хелатной "сшивки" (фиг. 5) в структуре МОЛКОН (фиг. 9) делает очевидным факт, что любое нарушение "сшивки" хотя бы в одном месте, должно сопровождаться разрушением всей "сшивки", несмотря на ее длину. Процесс разрушения "сшивок" между соседними молекулами НК, нарушающий анизотропное расположение молекул антибиотика, должен приводить к уменьшению амплитуды аномальной полосы в спектре КД. Это означает, что МОЛКОН можно использовать в качестве интегрального биодатчика, реагирующего на наличие в анализируемой жидкости химических или биологически активных соединений, которые тем или иным способом нарушают целостность структуры "сшивки".
Одно из применений МОЛКОН в качестве интегрального биодатчика учитывает тот факт, что молекулы многих химических и биологически активных соединений образуют комплексные соединения с ионами Cu2+, "вытаскивая" эти ионы из структуры полимерной хелатной "сшивки". Такой процесс должен сопровождаться не только нарушением целостности всей полимерной "сшивки", но и соответствующим уменьшением аномальной оптической активности МОЛКОН. Величина уменьшения аномальной оптической активности связана с концентрацией химического или биологически активного соединения, присутствующего в анализируемой жидкости и разрушающего полимерную хелатную "сшивку".
Ниже приведены примеры применения МОЛКОН на основе молекул ДНК для обнаружения белков и определения их концентрации.
Пример 4. Определение концентрации бычьего сывороточного альбумина (БСА) в растворе.
4.1. Готовят 1% раствор БСА ("Sigma") в H2O.
4.2. Из исходного раствора по п. 4.1 готовят серию растворов БСА в H2O с концентрацией 1,1 мкг/мл; 3,4 мкг/мл и 5,7 мкг/мл.
4.3. К 0,25 мл МОЛКОН по п. 1.3 добавляют 1,75 мл соответствующего раствора БСА по п. 4.2 при перемешивании и регистрируют спектры КД в области поглощения ДАУ (440 - 650 нм) с интервалом 5 - 10 мин.
При добавлении БСА амплитуда отрицательной полосы в спектре КД (фиг. 10), отражающая наличие полимерных хелатных "сшивок" между соседними молекулами ДНК в составе МОЛКОН, резко уменьшается. Это означает, что обработка МОЛКОН БСА приводит к разрушению полимерных хелатных "сшивок". Такое разрушение обусловлено образованием более прочных комплексов ионов Cu2+ с молекулами БСА и, следовательно, "уходом" ионов Cu2+ из состава полимерной хелатной "сшивки".
4.4. На основании данных по п. 4.3 строят зависимость изменения относительной амплитуды полосы в спектре КД (λ = 505 нм) от времени обработки молекулярной конструкции БСА для разных концентраций БСА (фиг. 11).
Данные, приведенные на фиг. 11, показывают, что уменьшение амплитуды полосы в спектре КД МОЛКОН в присутствии БСА зависит от его концентрации.
4.5. На основании данных по п. 4.4 (фиг. 11), выбрав фиксированные промежутки времени (например, 10 и 60 мин), строят зависимость изменения относительной амплитуды полосы в спектре КД (λ = 505 нм) от концентрации БСА (фиг. 12).
Наличие прямо пропорциональной зависимости между изменением относительной амплитуды полосы в спектре КД МОЛКОН и концентрацией БСА в растворе, в интервале его концентраций от 0 до 12 мкг/мл, позволяет использовать эту зависимость в качестве калибровочной прямой при определении концентрации БСА.
Таким образом, пользуясь МОЛКОН на основе молекул ДНК, можно не только судить о наличии БСА в анализируемой жидкости, но и определять достаточно низкую (≥ 0,5 мкг/мл) концентрацию БСА.
Пример 5. Определение концентрации "суммарного" белка в растворе.
5.1. Готовят 1% раствор (H2O) смеси белков (суммарного белка), состоящей из БСА ("Sigma"), инсулина ("Sigma") и пепсина ("Олайне) с соотношением их весовой концентрации 1:1:1.
5.2. Из раствора по п. 5.1 готовят серию растворов с концентрацией 1,2 мкг/мл; 3,4 мкг/мл и 5,5 мкг/мл.
5.3. К 0,25 мл МОЛКОН по п. 1.3 добавляют 1,75 мл раствора суммарного белка по п. 5.2 при перемешивании и регистрируют спектры КД в области поглощения ДАУ (440 - 650 нм) с интервалом 5 - 10 мин.
Уменьшение амплитуды отрицательной полосы в спектре КД (фиг. 13), отражающее разрушение полимерных хелатных "сшивок" между соседними молекулами ДНК в составе МОЛКОН, свидетельствует о наличие белков в растворе. Разрушение полимерных хелатных "сшивок" обусловлено связыванием ионов Cu2+ молекулами белков, присутствующих в растворе, и соответствующим "уходом" ионов Cu2+ из состава полимерных хелатных "сшивок".
5.4. На основании данных по п. 5.3 строят зависимость изменения относительной амплитуды полосы в спектре КД (λ = 505 нм) от времени обработки МОЛКОН суммарным белком для разной концентрации суммарного белка (фиг. 14). Данные, приведенные на фиг. 14, показывают, что изменение амплитуды полосы в спектре КД МОЛКОН зависит от концентрации суммарного белка в растворе.
5.5. На основании данных по п. 5.4 (фиг. 14), выбрав фиксированный промежуток времени обработки МОЛКОН суммарным белком (например, 10 и 60 мин), строят зависимость изменения относительной амплитуды полосы в спектре КД (λ = 505 нм) от концентрации БСА (фиг. 15).
Наличие прямо пропорциональной зависимости между относительной амплитудой полосы в спектре КД МОЛКОН и концентрацией суммарного белка (в интервале от 0 до 6 мкг/мл) позволяет использовать эту зависимость в качестве калибровочной прямой при определении низкой (≥ 0,5 мкг/мл) концентрации суммарного белка в анализируемой жидкости.
Таким образом, примеры 4 и 5 показывают, что МОЛКОН на основе жидкокристаллической дисперсии ДНК позволяет обнаруживать наличие в анализируемой жидкости как индивидуальных белков, так и их смесей.
Точность определения концентрации белков, составляющей ≥ 0,5 мкг/мл, вполне сопоставима с точностью классических методов (см., например, M.M.Bradford, Anal. Biochem, 1976, vol. 72, p. 248) определения белка. Однако, в отличие от названных методов, МОЛКОН может разрушаться не только в результате "вторичного комплексообразования" с различными группами анализируемых соединений, но и в результате восстановления ионов Cu2+ до Cu1+, целыми группами других соединений, например, аскорбиновой кислоты.
Следовательно МОЛКОН на основе двухцепочечной ДНК представляет собой интегральный биодатчик, свойства которого могут меняться от присутствия в анализируемой жидкости достаточно широкого круга соединений различной природы.
Прелагаемое изобретение может быть использовано в биосенсорике, медицинской и клинической биохимии, в молекулярной фармакологии, а также в наноэлектронике. МОЛКОН предназначен для использования в аналитической биотехнологии, экологии и медицине в качестве интегрального биодатчика, реагирующего, в частности, на изменение качества питьевой воды, в клинической биохимии и молекулярной фармакологии для использования в качестве "депо" высокой концентрации антибиотиков, а также для использования в нанотехнологии для создания новых конструкционных материалов с регулируемыми оптическими и электрохимическими свойствами.
Изобретение относится к области биотехнологии. Молекулярная конструкция представляет собой ансамбль из упорядоченных в пространстве жестких двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты (НК) ("строительных блоков"). Жесткие двухцепочечные молекулы НК упорядочены в виде комплекса (нуклеиновая кислота-антибиотик) в лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии, сформированного в водно-солевом растворе нейтрального полимера. Соседние молекулы НК фиксированы в пространстве полимерными хелатными "сшивками". Молекулярная конструкция предназначена для использования в аналитической биотехнологии, экологии и медицине в качестве интегрального биодатчика, в клинической биохимии и молекулярной фармакологии, а также для использования в нанотехнологии для создания новых конструкционных материалов с регулируемыми оптическими и электрохимическими свойствами. 2 с. и 10 з.п.ф-лы, 15 ил.
| ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ БИОДАТЧИК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ | 1989 |
|
RU2032895C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В АНАЛИЗИРУЕМОЙ ЖИДКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | 1996 |
|
RU2107280C1 |
| СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДАКТИЛОСКОПИИ | 1992 |
|
RU2081919C1 |
