Реактив для определения крови и гемоглобина в биологических жидкостях Советский патент 1978 года по МПК G01N33/16 

темном месте в хорошо закрытом сосуде не менее 48 ч. Органический алифатический, алициклический или гетероциклический амин, константа которого выше 8, взятый в избытке, стабилизирует соль органической гвдроперекиси с органическим амином и тем самым также предохраняет от разложения. Пригодным амином может быть не только алифатический, алициклический или гетероциклический амин, можно применять соль органической гидроперекиси с 1,4-диазабицшшо-(2,2,2)-октаном и для получения избытка амина используют другой амин, например 2-метил-2-амино-1,3-пропандиол или мочевичу, или смесь двух или нескольких этих аминов. Реактив содержит также полимерное природное 1ти синтетическое органическое пленкообразующее вещество, которо защищает всю индикационную зону от воздействия атмосферы, например от воздействия воздуха и влаги. 1 В качестве твердого полимерного природного или синтетического пленкообразующего вещества используют, например, альгинат натрия, поливинилпиролидон, поливиниловый спирт,- крахмал, попивинилпропионат, поливинилбутнрат, карбоксиметштцеллюлозу, полиэтиленгликоль с молекулярным весом 200015000, Можно применять и смесь двух или нескольких этих веществ. Так, в качестве кислотного буфера приме няют смесь многоосновной органической или минеральной кислоты с константой диссоциации рК liO-5,O и ее натриевой, калиевШ или аммониевой соли, или же смесь первичных или вторичных солей таких кислот, например буфер на основе смеси лимонной кис лоты, нитрата натрия, винной кислоты; тартрата натрия, яблочной кислоты, буры, моно фталата калия, нормального фталата калия или моносукцината натрия, нормального сукцината натрия. Вид и концентрация этого буфера не игрйют решающий роли, но величина рН, устанавливаемая с помощью буфера, долж на быть 2,5-5,0. В качестве хромогена используют органические вещества, которые устойчивы и cnocofr ны окисл5ггься применяемой гидроперекисью в присутствии гемоглобина, предпочитается бес цветность хромогена, этому условию удовлет воряют например (-тал:1Щин, 2,7-диаминофлуорен, о-дианизидин, бензрщин или ааме щениые азины и их соли, В качестве активатора пероксидазного действия гемоглобина используют хинолин и .его производные, например хинин, цинхонин, &-метоксихнноллн, хинальдин, 8-амино-6-метоксихинолин-; 2-хинолин и другие. Добавка этих активаторов ускоряет ход реакции окисления и повьпцает интенсивность окраски окисленной формы хромогена, что способствует повышению чувствительности реактива. OcHOBHbiM условием высокой стабильност реактива является отделение кислотного буфера и хромогена от соли органической гидроперекиси и органического амина. Это достигается тем, что на пригодную пропитывающую подложку, лучше на фильтровальную бумагу, наносят сначала водный или водноспиртовой раствор буфера и хромоген, а за- тем после тщательного высушивания на первую пропитку наносят раствор органической соли гидроперекиси с избытком амина, причем этот второй раствор приготавливают 6 неводных растворителях, таких как бензол, толуол, хлороформ, этилендихлорид, эфир, ацнлацетат и другие в смеси с метанолом, этанолом или пропанолом. Все другие компоненты могут быть добавлены к обоим пропиточным растворам. Иногда целесообразно, чтобы в первом пропиточном .использовали одно соединение, а но втором - другое, например, в первом пропиточном растворе - в качестве смачивателя - анионактивный лаурипсульфат или диалкилсульфосукщшат, а в качестве пленкообразующего полимерного соединения, например полив1шш1овый спирт, а во втором пропиточном растворе - в качестве неионогенного смачивателя - полиоксиэтнлированный лауригювый спирт или .этоксилированный олеиловый спирт, в качестве пленкообразующей добавки - поливинилпиролидон. Можно получить бумагу с трехкратным пропитыванием; а именно, первый пропиточный состав содержит кислотный буфер, хромоген, активатор пероксидазного действия гемоглобина, анионактивный смачиватель и поливинилпиролидон, второй - только поливиниловый спир или альгинат натрия или же смачиватель, а третий прописочный состав - соль органической гидроперекиси, органический амин, неионогенный смачиватель, а также поливиниловый спирт. При получении реактива, бумагу следует после каждого пропитывания тщательно высушивать перед нанесением следующего пропиточного состава. Реактив готовят таким образом, что все необходимые компоненты растворяют в импрегнируюшем растворе, который наносят на влагоемкую подкладку и высушиванием устpafKnoT растворитель использованный для подготовки раствора. Далее приведены примеры импрегнИру1О1Ц11 растворов, где содержание компонентов в граммах приведено на 10О мл раствора. Пример 1. Раствор 1. Хромоген (0,8-1,5 г о-толидивдихлоргидрата)0,25-2,50 Пленкообразующее вещество (0,8-1,5 г поливиниппиропидона)0,25-2,50 Активатор пероксидаэного действия гемоглобина (0,0080,8 г лепвдингвдрохлорнда)0,05-5,0 Смачивающее вещество (0,О5-О,25 г аниоактивного смачивающего вещества)0,002-2,0 Кислотный буфер рН 2,56,0 (20-ЗО мл 2 н.цнтратного буфера рН 3,О4,0)1О - 50 мл ЭтанолО - 5О мл Вода 50- 90 мл Раствор 2 , : Соль органической гидроперекиси (3-6 г соли фенилизопропилгидроперекиси с 1,4-диазобицшш о-(2,2,2)-октана)1-10 Органический амин (3-6 г 1,4 диазобицикло-(2,2,2)-октана0,05-20 Смачивающее веществоО,-1,0 Пленкообразующее вещество (5-8 г поливинилпиролидона) 1-10 Безводный растворитель (толуол или бензол)4О-100 м Низший алифатический спирт (безводный этанол)0-60 мл Благодаря такому приготовлению, отдел ные пропиточные составы полностью отделе ны друг от друга, так «ак бумагу высущив ют после каждого нанесения. После погружения в водную жидкость, н пример мочу, начинают взаимодействовать все компоненты, причем из солей органиче ких гидроперекисей под влиянием кислотно буфера выделяется свободная гидроперекис которая затем в присутствии гемоглобина окисляет хромоген с образованием окрашен го продукта окисления. Реактив для определения в крови гемог бина имеет кремовато-желтую окраску. После погружения реактива в воду или другую жидкость, например мочу, которая не держит ни гемоглобина, ни крови, реактив сохраняет свою первоначальную окраску, в присут твии же даже следов крови или гемо лобика он окрашивается в синий цвет, причем интенсивнсхзть этого окрашивания прямо пр порциональна количеству крови или гемогл бина, присутствующего в исследуемой жид кости. С{ авнивая с эталонной шкалой окра ки, изготовленной специально, можно с бо шой- точностью определить количество крови или гемоглобина по реактиву. Реактив для определения крови и гемогпобина в биологических жидкостях обладает большой чувствительностью и приобретает светло-голубое окрашивание уже в присутствии 1-2 эритроцитов в 1 мл воды или 5-1О эритроцитов в 1 мл мочи. Реактив довольно чувствителен к влаге воздуха, поэтому хранят его в герметичной упаковке над осушителем (например силика елем, молекулярными ситами). В таких условиях реактив может храниться в течение многих месяцев, не теряя чувствительности и не разлагаясь. Пример 1. Пропиточный раствор 1. 5,0 г о-толудиндш идрохлорида растворяют в смеси 10О мл 5%-ного водного раствора поливинилпиролидона, затем прибавляют 150 мл 2 н. цитратного буфера с рН 7,0; 5О мл 100%-ного водного раствора солянокислого лепидина и 1О мл 5%-ного водного раствора лаурипсульфата натрия. Пропиточный раствор II.. 4О г соли фенилизопропилгидроперекиси с 1,4-диазабицикло-(2,2,2)-октаном, 50 г 1,4-диазабщшкло-(2,2,2)-октана и 2О г поливинилпиролидона в указанной последовательности растворяют в 1000 мл 4%-ного раствора поливинилпиролидона в смеси этилового спирта и толуола 1:2. Приготавливают реактив следующим образом. На полоску фильтровальной бумаги плотностью 150 г/м и шириной ВО мм на расстоянии 6 мм от кромки наносят 5%-ный раствор этилцеллюлозы в спирте, высушивают, благодари чему осуществляется гидрофобное пропитывание; между слоем этой пропитки и кромкой бумаги наносят 2 мл пропиточного раствора I на 1 м бумаги и бумагу хорошо высушивают током горячего воздуха, нагретого до 80-85°С, На эту первую пропитку на 1 м бумаги наносят 1,6 мл пропи- .точного раствора II и бумагу высушивают.. Полоски бумаги затем разрезают поперек на полоски шириною 6 мм, благодаря чему получают реактив 6x80 мм, кремовато-желтого цвета, который она сохраняет после погружения, например в , в которой нет ни крови, ни гемоглобина. В присутствии же следов крови или гемоглобина в исспедуемой жидкости реактив приобретает антенсивную синюю окраску, причем выраженное синее окрашивание возникает уже при содержании крови в воде при разведении 1:5000000 и в моче при разведении : tlOOOOOO, что соответствует наличию 4-6 эритроцитов в 1 мл. с увеличением концентрации крови или гемогпобина в исследуемой