Способ выявления нестабильного гемоглобина в крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/72 

1

(21)4253420/28-14

(22)29.05.87

(46) 15.09.89. Бюл. № 34

(71)Центральный научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

(72)Т.П. Молчанова

(53)612.015X088.8)

(56)Carrell R.W. and Kay R. Simple Method for the detection of unstable haemoglobin. - But. Y. Haematology,

1972, V. 25, p. 615-629.

(54)СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕСТАБИЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ

(57)Изобретение относится к экспериментальной медицине, гематологии, а именно к способам выявления нестабильного гемоглобина в крови. Целью изоб- ретенил является упрощение способа. Берут кровь из пальца в количестве

0,1-0,2 мл капилляром, предварительно смоченным гепарином, отстаивают, плазму удаляют. Гемолизат не готовят, а для анализа используют эритроциты, которые в количестве 0,01-0,02 мл добавляют к 2,5-3 мл приготовленяой за 30 мин до анализа и тщательно перемешанной смеси 6,5-5,5% н-бутанола в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 МНа2 ЭДТАс рН 7,4 при 18-25 0. Суспензию эритроцитов в смеси осторожно перемешивают. Через 3±1 мин эритроциты донора и пациента растворяются в этой смеси, и суспензия становится прозрачной. Оба раствора - контрольный и исследуемый - инкубируют при 18-25°С. Через 5-60 мин раствор эритроцитов носителя нестабильного Нв мутнеет, а контроль остается прозрачным. Помутнение раствора регистрируют визуально или путем измерения оптической плотности при 700±5 нм. Установлена обратная зависимость между температурой и объемной концентрацией н-бутанола в фосфатном буфере.

§ .

(П

Изобретение относится к экспериментальной медицине, гематологии, а именно к способам выявления нестабильного гемоглобина в крови. Целью изобретения является упрощение способа. Берут кровь из пальца в количестве 0,1-0,2 мл капилляром, предварительно смоченным гепарином, отстаивают, плазму удаляют. Гемолизат не готовят, а для анализа используют эритроциты, которые в количестве 0,01-0,02 мл добавляют к 2,5-3 мл приготовленной за 30 мин до анализа и тщательно перемешанной смеси 6,5-5,5% н-бутанола в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 10^-3М NA₂ этилен диамино-тетрацксусной кислоты с PH 7,4 при 18-25°С. Суспензию эритроцитов в смеси осторожно перемешивают. Через 3±1 мин эритроциты донора и пациента растворяются в этой смеси, и суспензия становится прозрачной. Оба раствора - контрольный и исследуемый-инкубируют при температуре 18-25°С. Через 5-60 мин раствор эритроцитов носителя нестабильного Нв мутнеет, а контроль остается прозрачным. Помутнение раствора регистрируют визуально или путем измерения оптической плотности при 700±5 нм. Установлена обратная зависимость между температурой и объемной концентрацией н-бутанола в фосфатном буфере.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, к гематологии, а именно к диагностике, гемоглобинопатии, обусловленных носительством мутантных нестабильных гемоглобинов (Нв).

Цель изобретения - упрощение способа.

Цель достигается тем, что непосредственно эритроциты крови донора и пациента, взятой из пальца, суспензируют в специально приготовленной смеси нормального бутилового спирта - н-бу- танола с фосфатным буфером при 1825 С с получением прозрачного раствора. Наличие в крови нестабильного Нв регистрируют по помутнению раствора через 5-60 мин по сравнению с прозрачным контролем.

Способ осуществляется следующим образом.

Для,исследования кровь берут из пальца в количестве О,1-0,2 мл капилляром, предварительно смоченным гепарином. Затем кровь отстаивают в течение 30-60 мин, плазму удаляют. Для анализа используют эритроциты. Эритроциты в количестве 0,01-0,02 мл

3150

добавляют к 2,5-3 мл приготовленной за 30 мин до анализа и тщательно перемешанной смеси 6,5-5,5% н-бутанола в О,I М натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 М натриевой соли этилен- диаминотетрауксусной кислоты (Naj, ЭДТА) с рН 7,4 при 18-25°С. Суспензию эритроцитов в смеси осторожно переме- щивают палочкой или покачивая пробирку рукой. Через 3-1 мин эритроциты донора и пациента растворяются в этой смеси и суспензия становится прозрачной. Оба раствора - контрольный и исследуемый инкубируют при 18-25 С 30 мин. Через 5-60 мин раствор эритроцитов носителя нестабильного Нв мутнеет, а контроль остается прозрачным. Помутнение раствора регистрируют визуально или путем измерения рассеяния растворов без предварительного центрифугирования при 700-f5 нм на спектрофотометре.

Установлена обратная зависимость между температурой и объемной концентрацией н-бутанола в фосфатном буфере. Для различных интервалов температур составлена таблица, которой следует руководствоваться при выборе условий выявления нестабильного Нв в крови предложенным способом.

Пример 1 . Больная Б (Московская городская детская клиническая

больница № 1, история болезни № 9143) ,, Из пальца берут 0,15 мл крови гемато- страдает врожденной гемолитической критным капилляром. Кровь отстаивают 60 мин, плазму удаляют капилляром. 0,02 мл эритроцитов больной добавляанемией и цианозом. Из пальца берут 0,1 мл крови гематокритным капилляром. Отстаивают, через 30 мин плазму

удаляют капилляром. 0,01 мл эритроци- Q товленной и тщательно перемешанной тов больной добавляют при 20°С к 2,5 мл за 30 мин приготовленной и тщательно перемешанной смеси 6,5% н-бутанола в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, содержащем Ю М рН ремешивают путем покачивания пробир- 7,4. Аналогичным образом готовят кон- ки рукой. Через 3 мин суспензии эрит- троль. Смеси осторожно перемешивают путем покачивания пробирки рукой. Через 4 мин суспензии эритроцитов стают при 25 С к 3 мл за 30 мин пригосмеси 5,5% по н-бутанола в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 М Nag SflTA с рН 7,4. Аналогичным образом готовят контроль. Смеси осторожно пероцитов становятся прозрачными. Оба раствора инкубируют 60 мин при 25 С. Раствор эритроцитов больной через 60 мин мутнеет, а контроль остается прозрачным. После регистрации оптических плотностей при 700 нм на спектрофотометре Спекорд получают следующие показания: контроль 0,035 опт.ед,, больная - 0,93 опт.ед, У больной диагносцировано носительство нестабильного Нв.

ли прозрачными. Оба раствора инкубируют при . Через 5 мин раствор эритроцитов больной мутнеет, а контроль остается прозрачным. После регистрации оптических плотностей растворов на спектрофотометре Спекорд пр и 700 нм получают следующие показания: контроль 0,03 опт.ед., больная 0,7 опт.ед. У больной диагносцировано носи тельство нестабильного Нв

Пример 2. Больная Р (ЦНИИ гематологии и переливания крови МЗ СССР, история болезни № 299) страдает наследственной гемолитической анемией. Из пальца берут 0,1 мл крови капилляром, предварительно смоченным гепарином. Кровь отстаивают 45 мин, плазму удаляют капилляром. 0,015 мл эритроцитов больной добавляют при 23 С к 3 мл за 30 мин приготовленной и тщательно перемещанной смеси 6,0% н-бутанола в 0,1 Ы натрий-фосфатном буфере, содержащем с

рН 7,4. Аналогичным образом готовят контроль. Смеси осторожно перемешивают стеклянной палочкой. Через 3 мин обе суспензии эритроцитов становятся прозрачными. Инкубируют при 23 С. Через 15 мин раствор эритроцитов значительно мутнеет, а контроль остается прозрачным. После регистрации оптических Плотностей растворов при 702 нм на спектрофотометре Спекорд

получают следующие показания: контроль 0,02 опт.ед., больная 1,4 опт. ед. У больной диагносцировано носи- тельство нестабильного Нв.

Пример 3. Больная Ш (Московская городская детская клиническая больница № 1, история болезни № 17462) имеет жалобы на повьпиенную утомляемость, периодические.головные боли.

ют при 25 С к 3 мл за 30 мин приготовленной и тщательно перемешанной ремешивают путем покачивания пробир- ки рукой. Через 3 мин суспензии эрит-

смеси 5,5% по н-бутанола в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 М Nag SflTA с рН 7,4. Аналогичным образом готовят контроль. Смеси осторожно петовленной и тщательно перемешанной ремешивают путем покачивания пробир- ки рукой. Через 3 мин суспензии эрит-

роцитов становятся прозрачными. Оба раствора инкубируют 60 мин при 25 С. Раствор эритроцитов больной через 60 мин мутнеет, а контроль остается прозрачным. После регистрации оптических плотностей при 700 нм на спектрофотометре Спекорд получают следующие показания: контроль 0,035 опт.ед,, больная - 0,93 опт.ед, У больной диагносцировано носительство нестабильного Нв.

Упрощение способа выявления нестабильного Нв позволяет: проводить ана51508

ЛИЗ на микроуровне - на крови объемом- 0,1-0,2 мл, взятой из пальца; сократить стадии приготовления гемолиза- та, термостатироваиия и прецизионных спектральных измерений, которые дли- тельны и требуют использования специального оборудования. Введенные упрощения позволяют не только детектировать нестабильные Нв у гематолог гических больных, но и проводить массовые профилактические и популя- ционные обследования населе - ния.

686

Формула изобретения

Способ выявления нестабильного гемоглобина в крови, включающий взятие крови, получение эритроцитов и последующую обработку пробы органическим растворителем с последующей регистрацией оптической плотности пробы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, пробу эритроцитов инкубируют 30 мин при 18-25 С в смеси, состоящей из 6,5- 5,5% н-бутанола в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, при рН 7,4, содержащем 10 М этилендиаминтетраацетат натрия.