Штамм гибридных культивируемых клеток животных RаттUS NoRVeGIcUS,используемый для получения моноклональных антител к гликопротеиду базальных мембран ламинину Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в диагностике онкологических заболеваний . .

Цель изобретения - получение штам- 5 ма гибридньпс культивируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к нативному ламинину, работающие в радиоиммунологическом тесте.

Штамм получают следующим образом. - В качестве антигена используют монослойную культуру клеток мьшиной тератобластомы ТБ 3, суспендированную в забуференном физрастворе (ЗФР) с помощью мягкой резинки. Схема иммунизации: крысы линии Фишер получают . - 4 внутрибрюшинные инъекции по 2-3

«liO клеток каждая, первая - в равном объеме полного адъюванта Фрейн- да, последующие - в равном объеме не- .полного адъюванта. После первой инъекции следующую проводят через 3 недели, остальные - через 10-дневные интервалы. Последняя инъекция - внутривенно, в переднюю камеру глаза, без адъюванта, в объеме 0,2 мл (5-я иммунизация).Гибридизацию проводят на 4 день после 5-й иммунизации. Для зтого клетки селезенки иммунных крыс (10) гибридизуют с ЗхЮ клеток мышиной миеломы X63-Ag 8.653 с помощью. 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 1500. Культивирование гибридных клеток ведут в 96-луночньгх Платах на предварительно посаженных

ОП

00 01

31454851

перитонеальных макрофагах мьгаш (5-8 (

иЮ клеток на лунку). Питательная среда: среда Игла в модификации Дуль- бекко (ДМЕМ) с 20% эмбриональной те- лячвей сыворотки или 10% эмбриональной т елячьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, I мМ пирувата, 10 М гипоксантина, 4) аминоптерина

Характеристика полеэного продукта. МКА относится к классу 1вО(Г|(Н).

Специфичность - гликопротевд ба- эальных мембран ламинин. Антитела реагируют с тканями мыши, кролика, хомяка, человека. Метод оценки сохранения специфичности: иммунофлуорес- ценция (окрашиваются базальные мемi n|iWCV «en 1 nno у . Т о /ЬД. 1ЧГ1Л«« « ... ч.,. .- . -

и 1, тимвдина, 100 ед/мл гент- ю бР на срезах) и радиоиммунопрециг

амицина. Гибридомы клонируют 2 раэа, высевая на с макрофагами по 1 клетке. Отбор клонов осуществляют иммунофлуоресцентным окрашиванием культур клеток ТВ 3 и криостатных срезов почки мыши. Иэ 7,00 проверенных лунок с гибрндомами культуральная Лидкость (ЮК) одной из них реагирует в иммунофлуо есце нции с куль турами ТБ 3 (фибриллярное свечение) и ба-. эальними {ембранами почки мьппи, хомяка, кролика и человека, а в радиоим- мунопреципитационном тесте - с цельм ламинином (мол. массы 4рркП; + 200 кД). Полученный клон выводят в массовую культуру и обозначают ЛАМ. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур (институт цитологии АН СССР) под номером ; ВСКК (II) f 125D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда культивирования - среда Игла в модификации Дульбекко (ДМЕМ) -с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (или 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% лошадиной сьторотки), 1 мМ глутамина:, 100 ед. гентамицина в i мл. Клетки выращивают при И 5% углекислоты в атмосфере - Для выращивания штамма можно исполь 3OBfitb стеклянную ипи пластиковую посуду. Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды засевают 2-5x10 клеток ЛАМ. Пассаж - 1 раз в 4-5 дней той же дозой клеток. Вез подсчета клеток 1:3. Культивирование in vivo. Так как гибрвдома получен при слиянии клеток крысы и .мыши, культивирование in vivo в обычных животных невозможно.

Кариологические признаки. Модальпитация: антитела связывают с розой с пришитыми иммуноглобулинами кролика или козы против иммуноглобулинов крысы, инкубируют с меченным 15 аминокислотами или l лизатом мышиной те ратобластомы ТБ-24 или мьш1И- ной опухоли EHS, преципитат подвергают электрофорезу в присутствии доде- цилсульфата натрия (в градиентном 20 полиакриламидном геле 5-15%), выьу- шейньй гель подвергают авторадиографии. Положительная реакция проявляется присутствием на автографах двух меченых полос, соответствующих цепям 25 ламинина 20Р и 350-400 кД.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.

30 Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной те- льячей сыворотке, содержащей 10% ди- метилсульфоксида, в концентрации х10 кл. в 1 мл, раэливают в стерильные пластиковые ампулы при 4 С и замораживают в жидком азоте по программе со снижением температуры на 1 с/мин с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание: 1 мин 40 при . Клетки разводят в 5-10 мл пол- -ной среды, центрнфугируют при комнатной температуре 5 мин при 1000 об/мин, сливаиот среду, заливают 2 мл свежей среды и переносят в 2 лункй 24-луноч- ной ппага с предварительно посаженными перйтойеальными макрофагами мы- Щ1(25-40 1 о клеток на лунку) . Жиз- не(гпособность клеток по включению трипанового синего составляет 50-90%. П р й м е р 1. Кусочки почки, полученной от ев еже забито и мьш1и или от 16-20-недельного эмбриона человека при выкидыше, помещают в 7%-ный раствор желатина на ЗФР и немедленно

35

SO

нов число хромосом-81. Продуктивность. 55 штамма. Секреция моноклональных анти- хранят при -70 С. Срезы толщиной т1л на 5 день культивирования в I мл5 мкм готовят на криотоме. Фиксируют

мкг. Стабильная продукция МКА. ,5 мин в 10%-ном формалине и

сохраняется до 30 пассажей in vitro,пдательно отмьшают в ЗФР. Далее ста

Характеристика полеэного продукта. МКА относится к классу 1вО(Г|(Н).

Специфичность - гликопротевд ба- эальных мембран ламинин. Антитела реагируют с тканями мыши, кролика, хомяка, человека. Метод оценки сохранения специфичности: иммунофлуорес- ценция (окрашиваются базальные мем« «.. ч.,. .- . -

бР на срезах) и радиоиммунопрециг

бР на срезах) и радиоиммунопрециг

питация: антитела связывают с розой с пришитыми иммуноглобулинами кролика или козы против иммуноглобулинов крысы, инкубируют с меченным 5 аминокислотами или l лизатом мышиной те ратобластомы ТБ-24 или мьш1И- ной опухоли EHS, преципитат подвергают электрофорезу в присутствии доде- цилсульфата натрия (в градиентном 0 полиакриламидном геле 5-15%), выьу- шейньй гель подвергают авторадиографии. Положительная реакция проявляется присутствием на автографах двух меченых полос, соответствующих цепям 5 ламинина 20Р и 350-400 кД.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.

0 Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной те- льячей сыворотке, содержащей 10% ди- метилсульфоксида, в концентрации х10 кл. в 1 мл, раэливают в стерильные пластиковые ампулы при 4 С и замораживают в жидком азоте по программе со снижением температуры на 1 с/мин с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание: 1 мин 0 при . Клетки разводят в 5-10 мл пол- -ной среды, центрнфугируют при комнатной температуре 5 мин при 1000 об/мин, сливаиот среду, заливают 2 мл свежей среды и переносят в 2 лункй 24-луноч- ной ппага с предварительно посаженными перйтойеальными макрофагами мы- Щ1(25-40 1 о клеток на лунку) . Жиз- не(гпособность клеток по включению трипанового синего составляет 50-90%. П р й м е р 1. Кусочки почки, полученной от ев еже забито и мьш1и или от 16-20-недельного эмбриона человека при выкидыше, помещают в 7%-ный раствор желатина на ЗФР и немедленно

5

SO

55 хранят при -70 С. Срезы толщиной 5 мкм готовят на криотоме. Фиксируют

1454851

патии молочной желеэы человека. Кусочек ткани молочной желеэы, удаленный при биопсии, заливают в желатин и за мораживак1т не позднее 1 ч после операции. Далее материал обрабатывают, как указано в примере i. На срезе отмечают положительную реакцию с ба- зальными мембранами пролифератов. Эпителиальные и стромальные клетки не окрашены. Следовательно, ламинин содержится только в составе базальнь мембран. Непрерывный характер окраши вания базальных . мембран указывает на

вят реакцию непрямой иммунофлуорес- ценции при комнатной температуре. Первая инкубация 1 ч - КЖ клеток штамма ЛАМ. После отмывки в ЗФР вто- рая инкубация - кроличья антисьшорот- ка к иммуноглобулинам крысы, меченная флуоресцеинизотиоцианатом в раз- ведении 1:20 после предварительного истощения .сьгеоротки печеночным порош- ю ком мьшш. Инкубация 1 ч, затем отмывка в ЗФР. Срезы заключают в глицерин на ЗФР (1:1). Контроль - первая инкубация с ЗФР вместо МКА.;.

Препарат исследуют в микроскопе is доброкачественную природу опухоли с флуоресцентной приставкой, отмечают свечение базальных мембран почки. При этом в клубочках почки мьши гло- мерулярные базальные мембраны слабо окрашены, в клубочках почки человека - нет. Клетки канальцев, эндотелий сосудов, строма не. окрашены, следовательно, иё содержат ламинина.

Таким образом, полученные МКА специ---.

фически выявляют гликопротеид базаль-25 клеток животных Rattus.norvegicus Lx мембран ламинин и не взаимодействуют ВСКК (II) № 125D, используемый для, с-другими белками клетки. получения моноклональных антител .

Прим е р 2. Иммунолокализация . гликопротевду базалЬных мембран ла ламинина в фиброзно-кистозноймасто- минину.

20

Приведенный пример подтверждает возможность использования полученных МКА для диагностики опухолевых забо леваний человека.

Форм

у л а и 3 о б р е т е

кия

Штамм гибридных культивируемых

патии молочной желеэы человека. Кусочек ткани молочной желеэы, удаленный при биопсии, заливают в желатин и за- мораживак1т не позднее 1 ч после операции. Далее материал обрабатывают, как указано в примере i. На срезе отмечают положительную реакцию с ба- зальными мембранами пролифератов. Эпителиальные и стромальные клетки не окрашены. Следовательно, ламинин содержится только в составе базальньк мембран. Непрерывный характер окрашивания базальных . мембран указывает на

доброкачественную природу опухоли

Приведенный пример подтверждает возможность использования полученных МКА для диагностики опухолевых заболеваний человека.

доброкачественную природу опухоли

Форм

у л а и 3 о б р е т е

кия

рокачественную природу опухоли

--.

Штамм гибридных культивируемых

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в диагностике опухолевых заболеваний. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животньк-Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к нативному ламинину, работающие в радиоиммунологическом тесте. Штамм получают гибридизацией сплено- ; цитов крысы, иммунизированной клетками мышиной тератобласТОМЫ, с клетками миеломы X63-Ag8.653. Продукция МКА на 5-й день культивирования составляет 5-10 мкг/мл. МКА относятся к классу IgGi-(H). Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран ламинином (двумя его цепями мол.м. 200 и 350-400 кД). Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% змбриональной телячьей сьшоротки, модальное число хромосом в клетках штамма 81. с SS С/)

,Составитель М. Серова

Редактор Н. Киштулинец Техред М.ХрданичКорректоре. Шекмар

Заказ 7411/30

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного кo итeтa по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-ЗЗ, Раушская наб., д. 4/5

Подписное