Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному белку вируса гепатита А человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для диагностики вируса гепе- тита. А.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинатному белку вируса гепети- та А.

Штамм получают:следующим образом.

Клетки мышиной миеломы NSO гибри- дизируют. с клетками селезенки мыши

линии BALB/C, иммунизированной реком- бинатным белком вируса гепатита.А (РБ ВГА),человека, по схеме, обеспечивающей макси 1альный имунный ответ для данного антигена. В результате селекции полученных клеток на среде ГАТ, скрининга гибридом по признаку продукции антител к рекомбинантному белку вируса гепатита А и последующего клонирования отбирают штамм (ВСКК(Ц) № 286Д (название HAV-1-28), стабильно продуцирующий МонАТ к рекомбинатному белку вируса гепатита А.

(Ю СА

Штамм хранится в Специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР - ВСКК(П), регистрационный номер депонирования - ВСКК(П) 286Д. К моменту депонирования штамм прошел 20 пассажей, г Штамм характеризуется следующими свойствами.

Стандартные условия выращивания. (Штамм культивируют на ростовой среде ДМЕ/F (1:1) с добавлением 50 мкМ меркаптоэтанола 1% концентрата несущественных аминокислот, 15. мМ HEPES, 10% сыворотки эмбриона коровы

Культуральные свойст ва. Клетки культивируют в стеклянных или пластиковых сосудах в закрытой системе или в атмосфере 5%-ного COj. Клетки пересевают встряхиванием 2 раза в неде- лю в соотношении 1;3,

Характеристика культивирования гибридомы в организме животного.

1-1 -10 клеток гибридомы в бессывороточной среде вводят внутрибрю- шинно мышам линии BALB/C, которым за 7-10 дней до прививки инъецировали 0,5 мл пристана или вазелинового масла внутрибрюшинно. Асцит образуется через 10 дней после прививки клеток,

Контаминация. Грибы, бактерии, микоплазма отсутствуют.

Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом. Клетки секретируют иммуноглобулины IgGgg, взаимодействующие с рекомбинатным белком вируса гепатита А и цельным вирусом в твердофазном иммунофермент ном тесте. Эпитоп локализуется на. фрагменте Vp1.

Характеристика биосинтеза полезных продуктов. Титр антител в асцит- ной жидкости в иммуноферментном тес- те при нанесении на твердую фазу 1 мкг/мл рекомбинатного белка виру- са гепатита А составляет более 10 Штамм стабилен около 30 пассажей in vicro и 2 пассажа in vitro (срок наблзодения). ,

Криококсервирование. Клетки заморажива от в ростовой кондиционирован- ной среде с 10% ДМСО, Режим замора- яогвания и отогрева обычный д.пя клеточных культур. Жизнеспособность 1члеток после криоконсервации 70%.

Пример. Кажчая мьппь BALB/ .предварительно полух1ает внутрибрюшино по 0,5 мл пристана. Через 10 дне

таким животным инъецируют гибридные; клетки.. Для этого культивируемые клетки в логарифмической фазероста стерильно ;центрифугируют 7 мин при1 1000 об/мин на центрифуге. Осадок клеток отмывают стерильным - раствором Хенкса, повторно центрифугируют при тех же условиях и суспензируют снова в стерильном растворе Хенкса. Каждой из трех мышей внутрибрюшинно инъецируют по 0,5 мл суспензии, содержащей 2-10 гибридных клеток. Через 14 дней мышей забивают, из брюшной полости извлекают асцитную жидкость. Клетки из асцитной жидкости отделяют центрифугированием и используют для прививки гибридом, а в надосадочной жидкости определяют титр антител с помощью стандартного иммуноферментного анализа.

В пластины для иммунологических исследований вносят по 50 мкл раствора рекомбинатного белка (фрагмент Vpl) в 0,1 М бикарбонатном буфере, рН 9,5 в концентрации 1 мкг/мл. После инкубации в течение ночи пластины отмьшают PBS с 0,05% твина -20 . и наносят асцитную жидкость с моно- клональными антителами в разведении от до 10. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре пластины снова отмывают PBS с 0,05% тви- на-20 и наносят ко}1ъюгат бараньих антител к .иммуноглобулинам мьш1и с пероксидазой хрена (разведение 1: :2500). После одночасовой инкубации и отмывки добавляют раствор субстра та - хромогена (5 мг ортофенилендиа мина в 10 мл цитратного буфера рН 4, и 5 мкл 30% .). Через 30 мин определяют оптическую плотность при 492 нм. При разведении асцитной жидкости в .10 раз оптическая плотнос составляет 0,753, в контроле. 0,004. TaKi-iM образом, титр антител а асцитной жидкости HAV-1-28 не менее 10.

Характеристика МонАТ, продуцируемых штаммом гибридомы 286Д.

МонАТ, секретируемые клетками гибридомы штамма 286Д, связываются как с рекомбинантным белком вируса гепатита А, так и с цельным вирусом Пример2. В лунки иммунопа- вносят по 75 мкл сыворотки ре- конвалесцента гепатита А, разведенной в Ю- раз в 0,,1 м бикарбонантн буфере, рН 9,6.

516

После инкубации при комнатной темпертуре в течение 1А-18 ч отмывают PBS с 0,05% твина-20. Затем на- ,носят в лунки по 50 мкл очищенного вирусагепатита А (р - 1,34 CsCl), инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре, отмывают, как описано, и наносят на 14-18 ч 50 мкл в лунку моноклональных антител в культураль- ной среде. После отмывки панели инкубируют при тех же условиях с пе- роксидазным конъюгатом козлиных антимышиных иммуноглобулинов. Затем добавляют раствор субстрата - хромогена и определяют оптическую илот- кость, как описано. Оптическая плотность в опыте составляла 0,528, в контроле - 0,150. Таким образом.

1930.

МонЛТ штамма HAV-1-28 узнают не только рекомбинатные белки, но и цельный вирус гепатита А.

Методом йммуноблодтинга установлено, что как в рекомбинатных белках, так и в цельном вирусе эпитопя МонАТ HAV-1-28 локализируется на Vp1 - основном поверхностном антигене вируса гепатита А.

15

20

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musoulus L , ВСКК(П) № 286Д - продуцент моноклональных антител к рекомбинатному белку вируса гепатита А человека.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики вируса гепатита А. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к рекомбинатному белку (РБ) вируса гепатита А (ВГА). ШТАММ ПОЛУЧАЮТ ГИБРИДИЗАЦИЕЙ КЛЕТОК МЫШИНОЙ МИЕЛОМЫ NSO с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной РБ ВГА. ШТАММ ДЕКОНИРОВАН ПОД НОМЕРОМ ВСКК(П) 286Д. ШТАММ КУЛЬТИВИРУЮТ В РОСТОВОЙ СРЕДЕ ДМЕ/Р₁₂ (1:1) с добавлением 50 мкМ меркаптоэтанола, 1% концентрата аминокислот, 15MM HEPES - буфера, 10% сыворотки эмбриона коровы

в атмосфере 5% CO₂. Клетки пересевают 2 раза в неделю в соотношении 1:3. Клетки секретируют МонАТ класса IGG2B, взаимодействующие с РБ ВГА. ТИТР МОНАТ В АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ ТЕСТЕ ПРИ НАНЕСЕНИИ НА ТВЕРДУЮ ФАЗУ 1 МКГ/МЛ РБ ВГА составляет 10^-8. Штамм стабилен 30 пассажей.

Составитель А.Маныкин Редактор Н.Бобкова Техред М.Ходанич

Заказ-3812

Тираж 493

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101,

Корректор Т;Малец

Подписное