Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к вирусу гепатита А человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к иммунологии и гибридомной технологии и может быть использовано для целей диагностики вируса гепатита А (ВГА).

Целью изобретения является создание нового штамма гибридных культивируемых клеток - продуцента моноклональных антител к ВГА человека, обеспечивающего высокий уровень синтеза моноклональных антител (мон AT).

Штамм получают при слиянии миелом- ных мышиных клеток Ag 8.653.X63 со спле- нацитами мышей линии Balb/c.

Слияние проводят при помощи полиэти- ленгликоля мол. массы 4000 с 10 об.% диметилсульфоксида.

Селекцию гибридных клеток осуществляют на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин. тимидин.

Штамм клонируют дважды. После второго клонирования практически 100% клонов являются положительными.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки штамма имеют округлую форму, ядро занимает большую часть клетки.

Культуральные признаки.

При суспензионном культивировании в среде RPMIi640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки клетки слабо прикреплены к субстрату.

Продуктивность штамма.

о ел

XI

ел ю VI

При культивировании In vitro штамма БН-1 концентрация иммуноглобулинов составляет 10 мкг/мл при плотности клеток 1 млн/мл в асцитной жидкости 5 мг/мл. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 50 пассажей в культуре.

Характеристика полученного продукта.

Мон AT, продуцируемые штаммом клеток БН-1, используют в качестве сенсибилизирующих антител при диагностике ВГА методом иммуноферментного анализа.

Штамм перевивается мышам линии Balb/c. клетки продуцируют иммуноглобулины G-2a (определение проводят при помощи твердофазного иммуноферментного анализа, в качестве вторичных антител используют кроличьи антитела против различных классов иммуноглобулинов мышей, конъюгированных с пероксидазой хрена).

Штамм получил название БН-1 и депонирован под номером ВСКК (II), № 332 Д.

Пример. 1. Получение штамма гибридных клеток БН-1.

Проводят иммунизацию мышей и гибридизацию клеток.

Самок мышей линии Balb/c иммунизируют по схеме: 15-й день - 40 нг гепатита вируса А вводят в полном адъюванте Фрейда внутрибрюшинно; 7-й день - 40 нг белка вводят в неполном адъюванте Фрейда внутрибрюшинно; 4,3 и 2-й дни - по 40 нг белка вводят внутрибрюшинно; 0-й день - мышь забивают. Селезенку забирают асептически, переносят в чашку Петри и получают клеточную суспензию. Отмытые средой RPMH640 60 млн клеток селезенки смешивают с клетками миеломы в соотношении 1:1, центрифугируют 10 мин(200хд). Надосэдоч- ную жидкость осторожно удаляют и к клеточному осадку по каплям добавляют в течение 1 мин 1 мл 50%-ного раствора по- лиэтиленгликоля мол. массы 4000 с 10 об.% диметилсульфоксида в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2). Затем в течение 5 мин добавляют 10 мл среды RPMIi640 и в течение еще 10 мин доводят объем среды в пробирке до 50 мл.

Клетки центрифугируют в течение 3-5 мин, осторожно удаляют надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 50 мл среды RPMI1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1x10 М гипоксантина, 4x10 М аминоптерина, 1, М тими- дина, 20 тМ L-глутамина, суспендируют клетки пинетированием и распределяют в 96-луночные плейты по 50х103 клеток в 100 мкл среды в лунки, в которые за день до гибридизации высаживают мышиные пери- тонеальные макрофаги (5x103 клеток в лун ку). Клоны гибридных клеток становятся заметными через 10-12 дней. Тестирование клонов проводят, когда клоны заполняют лунку на 20%. Положительные культуры клонируют методом предельного разведения в 96-луночных панелях на фидерном слое пе- ритониальных макрофагов, внося по 30, 300 и 30000 клеток на панель.

Для получения асцитов самкам мышей

0 Balb/c за 10-14 дней до инъекции гибридных клеток внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл пристана.

При введении (2-4)х106 гибридных клеток у мышей через 14-20 дней образуется

5 асцит.

П р и м е р 2. Иммуноферментный анализ мон AT БН-1.

Образцы, содержащие антитела (супер- натанты клеточных культур либо асцитные

0 жидкости), тестируют методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Лунки 96-луночной панели покрывают в разведении 1:2000 сыворотки реконвалес- цента, содержащей антитела к вирусу гепа5 тита А в 0,1 М карбонатном буфере (рН 9.5) и оставляют на ночь при 20°С. Затем лунки плейты отмывают 0,05%-ным раствором твина-20 в 0,01 М натрийфосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCI (ФСБТ) рН 7,4 и

0 инкубируют с препаратом вируса гепатита А в течение ночи при комнатной температуре. Затем лунки плейт отмывают 3-4 раза ФСБТ и вносят по 50 мкл препарата, содержащего тестируемые антитела. После инку5 бации в течение HO4Vi при комнатной температуре панель отмывают ФСБТ и обрабатывают раствором кроличьих антимышиных антител, коньюгировэнных с пероксидазой хрена (50 мкл в лунку; разве0 дение 1:1000; 1 ч при 37°С).

Затем панель тщательно отмывают и вносят 50 мкл раствора ортофенилендиами- на(1 мг/мл в 1%-ном цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 0,05% Н202). Реакцию ос5 танавливают добавлением в лунку 50 мкл раствора 2 М серной кислоты.

П р и м е р 3. Определение концентрации БН-1 антител в культуральной и асцитной жидкостях.

0 В лунки 96-луночной панели вносят по 250 нг кроличьих антител кЗд мыши в 0,05 М бикарбонатном буфере (рН 9,6) и инкубируют 18 ч при 4°С. Затем лунки панели отмывают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1%

5 БСА (1 ч, 37°С). После отмывки лунок ФСТБ в них вносят серийные разведения тестируемых образцов, содержащих МкАТ, параллельно с серийными разведениями стандарта нормальных мышиных иммуноглобулинов и инкубируют 1,5 ч при 37°С. Затем лунки панели тщательно отмывают ФСБТ и обрабатывают раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгирован- ных с пероксидазой хрена (50 мкл в лунку, разведение 1:1000,1 ч при 37°С). После это- го панель тщательно отмывают и вносят в лунки по 50 мкл раствора ортофенилендиа- мина (1 мг/мл) в 1 %-ном цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 0,05% Н202. Реакцию останавливают добавлением в лунку 50 мкл раствора 2 М серной кислоты. Концентрацию иммуноглобулинов в тестируемых образцах определяют по калибровочной кривой, полученной со стандартами нормальных мышиных иммуноглобулинов.

Г) р и м е р 4. Получение и очистка мои AT из культуральной и асцитной жидкости.

Гибридные клетки наращивают в пластиковых матрацах в среде РРМНздо, содержащей 10% ЭТС, 300 мг/л L-глутамина, 5x10 М маркаптоэтанола при посевной концентрации 3x105 кл/мл. Максимальная продукция иммуноглобулинов через 5-6 дней составляет 10 мкг/мл. Антитела, находящиеся в культуральной жидкости, осаж- дают сульфатом аммония (27,7 г на 10 мл культуральной жидкости), промывают 0.2 М сульфатом аммония. Осажденные сульфатом аммония и отдиализованные против ФСБТ в течение 1 сут образцы наносят на колонку с ДЕАЕ сефарозой, предварительно уравновешенную буфером (10 мМ т рис

рН 8,0 из расчета 10 ,иг белка на 1 мл ионооб- менника). Элюируют линейным градиентом NaCI (от 0 до 300 мМ) 15-20 обьемом колонки. Иммуноглобулины элюируются при 0,12 М NaCI.

Раствор иммуноглобулинов диализуют против забуференного физиологического раствора (рН 7,2). Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии до- децилсульфата натрия. Для получения иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки приливают мышам линии Balb/c. За 10-14 дней до инъекции клеток мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл при- стана.

Яри введении (2-4)х 106 клеток через 14- 20 дней образуется асцит. После отделения клеток центрифугированием (10 мин. 400хд) асцитную жидкость разбавляют в 4 раза и проводят высаливание, дальнейшую очистку иммуноглобулинов проводят как описано.

Таким образом, получают высокопродуктивный штамм гибридных клеток БН-1, продуцирующий мои AT к вирусу гепатита А человека.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L BCKK(II) № 332Д - продуцент моноклональных антител к вирусу гепатита А человека.

Изобретение относится к иммунологии и гибридомной технологии и может быть использовано для целей диагностики вируса гепатита А (ВГА). Целью изобретения является создание нового штамма гибридных культивируемых клеток - продуцента моно- клональных антител (мон AT) к ВГА человека, обеспечивающего высокий уровень синтеза мон AT. Штамм - продуцент мон AT к нативному ВГА - получен от слияния мие- ломных клеток Ag 8.653.X63 со спленоцитами мышей линии Batb/c, иммунизированных препаратом нативного ВГА. Слияние проводят при помощи ПЭГ с мол. массой 4000, содержащего 10 об.% диметилсульфоксида в фосфатнобуферном растворе. Клетки штамма культивируют в среде RPMItwo с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Продуктивность штамма составляет 10 мкг мл в культуральной жидкости и 5 мг/мл в асцитической жидкости. Клетки продуцируют мон AT, специфичные к ВГА, принадлежащие к G-2a иммуноглобулинам. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 332 Д. Ё