ШТАММ STREPTOMYCES AVERMITILIS ФБМ 0004 - ПРОДУЦЕНТ ОЛИГОМИЦИНОВ Российский патент 2000 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к получению биологически активных веществ микробиологическим путем, а именно к производству препаратов, применяемых в биологических исследованиях в качестве ингибиторов оксидазного фосфатирования.

Предшествующий уровень техники
Известны штаммы Streptomyces avermitilis, продуцирующие помимо основного целевого продукта (авермектинов) и некоторое количество олигомицинов, в частности штамм S. avermitilis ВКМАс 1301 (Дриняев В.А., Кругляк Е.Б. и др., Streptomyces avermitilis - продуцент олигомицина. Биотехнология, 1994, N 7, с. 30-34) или S. avermitilis АТСС 31272 (Onishi J.C., Miller T.W. The lack ofantifungal activity by avermectin B_la. The journal of antibiotics. 1985, XXXVIII, 11, p. 1568-1572). Однако продуцируемые количества олигомицинов весьма малы для широкого практического использования, например, в биологических исследованиях.

Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является создание штамма, Streptomyces avermitilis, продуцирующего олигомицины А (85-90%) и С (10-15%) в более значительных количествах. Предлагаемый штамм Streptomyces avermitilis 0004ФБМ получен из популяции штамма Streptomyces avermitilis 003ФБМ путем естественного отбора вариантов по признаку образования олигомицинов (фиг. 1). Штамм продуцирует в среднем 1000 мкг/мл олигомицинов.

Полученный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Микроморфологические признаки штамма.

Спороносцы образуются в виде правильных спиралей (более восьми витков).

Макроморфологические и культуральные признаки.

На 2%-ном глюкозо-картофельном агаре на 14-21 день роста при 28^oC, pH 6,8-7,2 образуются колонии диаметром 10-12 мм с серым воздушным и светло-желтым субстратным мицелием. Край колоний неровный.

Данные о росте культуры на различных органических и синтетических агаризованных средах представлены в таблице 1.

Сведения о физиолого-биохимических признаках Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 приведены в таблице 2, где использованы следующие обозначения: (+++) - обильный вегетативный рост; (++) - умеренный рост; (+) - слабый рост; (-) - отсутствие роста.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Споры штамма Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 выращивали на овсяном агаре в течение 10 суток при 28^oC. Кусочек агаровой среды (≈ 1 см²) со спорами вносили в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержавшие 75 мл посевной среды следующего состава, %: глюкоза - 4,0; соевая мука - 0,6; кукурузный экстракт - 0,3; сухие дрожжи - 1,0; CaCO₃ - 0,1; K₂HPO₄ - 0,06. Глюкозу стерилизовали отдельно при 0,5 ати 30 минут и вносили в колбы в момент засева. Остальные компоненты стерилизовали при 1,2 ати 40 минут. Значение pH до стерилизации 6,5-6,8.

Колбы устанавливали на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивали инокулят при 28^oC в течение 28 часов. Затем инокулят в количестве 5% переносили в колбы с ферментационной средой следующего состава, %: глюкоза - 7,0; кукурузный экстракт - 0,3; соевая мука - 0,9; сухие дрожжи - 1,0; вода водопроводная.

Ферментацию проводили а течение 192 - 240 часов при 28^oC.

Олигомицины выделяли из мицелия следующим образом. Из 10 мл культуральной жидкости отделяли центрифугированием осадок. К влажному осадку добавляли 10 мл охлажденной водопроводной воды, тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к влажному и промытому осадку добавляли 10 мл этанола и проводили экстракцию олигомицинов при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 30 минут. После отделения при 3000 об/мин в центрифугатах определяли содержание олигомицинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), основанной на хроматографическом разделении олигомицинов на аналитической колонке с обращенной фазой Диасорб 130 с 16Т 4х250 мм. Элюирующей системой служила смесь метилового спирта и ацетонитрила с водой в соотношении 21,8 : 6,8 : 4,8. Детектирование компонентов вели в УФ-диапазоне при длине волны 225 нм.

Среднее содержание олигомицинов в мицелии Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 составило 1000 мкг/мл при размахе изменчивости по данному признаку 800 - 1200 мкг/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 позволяет получать 1000 мкг/мл олигомицинов в культуральной жидкости. Компонентный состав олигомицинов: олигомицин А - 85-90%; олигомицин С - 10-15% (фиг. 2).

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм Streptomyces avermitilus 0004ФБМ получен из популяции штамма Streptomyces avermitilus 003ФБМ путем естественного отбора вариантов по признаку образования олигомицинов. Которые могут быть применены в биологических исследованиях в качестве ингибиторов оксидазного фосфатирования. 2 табл., 2 ил.

Штамм Streptomyces avermitilis ФБМ 0004 - продуцент олигомицинов.