Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики гемобластозов человека.
Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животньк Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) ,к дифференцировочному антигену В - лимфоцитов человека, экспрессированному на различных стадиях дифференциров- ки от незрелых В-клеток до плазмо- бластов.
Штамм получают следующим образом.
Клетки селезенки иммунизированной мыши линии BALB (с гибридизуют с |клетками мышиной миеломы P3-X63-Ag- 8.653. Для иммунизации используют линию клеток Daudi, полученную из лимфомы Беркитта. Мьш1Ь линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинно по 8х х10 клеток 3 раза с интервалом 1 мес. и внутривенно 18x10 клеток. Через 4 дня после внутривенного вве- дення клеток проводят соматическую гибридизацию с цомощью 50%-ного по- лиэтиленгликоля м.м. 2000 клеток селезенки с клетками миеломы. Клетки разливают в 96-луночные пластиковые планшеты. Для культивирования гибридных клеток на первых этапах используют среду MEM в модификации Дальбекко с 15%-ной лошадиной сьшо- ротки. После слияния в культуры клеток .в течение двух недель добавляют НАТ-среду (конечная концентрация гипоксантина
10 М,
аминоптерина
4x10 М, тимидина 1,6х10 -М, а затем в течение одной недели НТ-среду.
После селекции гибридов в HAT- и НТ-средах рост клонов гибридом выявляют в 107 из 192 лунок. Скрининг специфической антительной активности проводят методом иммунофлуоресценции в непрямом варианте на монослое живых клетокi Клетки прикрепляют на предметные стекла, обработанные раствором поли- L-лизина (100 мкг/мл, м.м. 40000-80000). При иммунофлуорес- центном анализе супернатантов гибридом специфическую антительную активность обнаруживают в 22 лунках, а при клонировании способность синтезировать антитела к клеткам Daudi сохраняют 9 клонов гибридом. Клонирование методом лимитирующих разведений проводят 2 раза с использованием перито- неальных макрофагов мьяпей BALB/c в качестве фидера. После реклонирования
и пассирования in vitro отбирают 1 клон гибридомы А7, клетки которого активно продуцируют антитела к поверхностным антигенам клеток линии Daudi.
Штамм А7 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Q Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) № 77Д и характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
По цитоморфологическим признакам 5 клетки мьшиной гибридомы штамма А7 преимущественно похожи на лимфоциты среднего размера типа бластньк клеток, с высоким ядерно-цитоплазмати- ческим отношением, вьфаженной базофи- 0 лией цитоплазмы. В цитоплазме клеток не обнаружена активность фермента пероксидазы, активность кислой фосфа- ,тазы слабо-диффузная, а умеренная гранулярная реакция на неспецифичес- 5 кую о(-нафтилацетатэстеразу сохраняется при действии ингибитора NaF.
Культуральные признаки.
Среда культивирования - среда RPMI-1640 с 10%-ной донорской телячьей сыворотки, 4 tM L-глутамина, 100 мкг/мп гентамицина при 37°С и в атмосфере 5% СО. Для вьфащивания штамма используют пластиковую или стеклянную посуду, посевная доза - 100 тыс. кл/мп, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева - 1:10. Культура суспензионная. Для выращивания асцита используют мышей линии BALB/C. Мьш1ам за 7- 30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл притана. Клетки инъетдируют внутрибрюшинно по 2-5x10 клеток в 5 мл сре- цы Игла. Асцит формируется через 12-14 дней.
Продуктивность штамма.
Секреция МКА на 3-4 день культивирования in vitro составляет 15-, 20 мкг/мл культуральной среды и 7,8 мг/мл асцитической жидкости,Продукция МКА сохраняется до 20 пассажей in vitro и до 3-х пассажей in viva
Характеристика полезного продукта.
МКА относится к классу IgG3. Они выявляют дифференцировочный антиген 5 в -лимфоцитов человека, экспрессиро- ванный на различных стадиях диффе- ренцировки - от незрелых В - клеток до плазмобластов.
0
5
0
5
0
31420020
Koнтaминa l iя. При длительном наблюдении и посе- -
Таблица 1 ,
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики гемобластозов человека. Целью изобретения является получение пугамма гибридных культивируемых клеток животных Миз musculus, .продуцирующего моноклональные антитела (МКА) .к диффер.енцировочному антигену В-лим- фоцитов человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных клетками линии Daudi с клетками миеломы РЗ-ХбЗ-Ag 8.653. Штамм культивируют на среде RPMI-1640 с 10% донорской телячьей сыворотки, посевная доза 100 тыс. кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10, культура суспензионная. Продукция МКА на 3-4 день культивирования in vitro составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 7,8 мг/мл асцитической жидкости. МКА- относятся к классу IgG3 и выявляют дифференцировочный антиген В - лимфоцитов человека, зкспрессированньй. на различных стадиях дифференциров- ки - от незрелых В - клеток до плаз- мобластов. МКА используют для диагностики лимфоидных форм лейкозов и лимфом. 2 табл. 2 о со
вах на питательные среды бактерии и грибы в культуте не обнаружены.
Криоконсервирование.
Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячей сьюоротке с добавлением 10%-ного диметилсульфоксида, Режим замораживания: в минуту до +4 С, .затем 1°С в минуту до -70°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание - на водяной бане при 37°С. Л&1знеспособность клеток после размораживания - 70-80% по окрашиванию трипановым синим.
Использование штамма А7 иллюстрируется следующим примером.
Пример. О,05 мл тестируемых антител в соответствующем разведении наносят на клетки-мишени (20 мин при 37°С), прикрепленные на предметные стекла, покрытые поли- L-лизином. Далее, отмывают клетки культуральной средой от избытка антител, инкубиру-. ют в течение 20 мин при 37 С с кроличьей сывороткой, меченой FITC, вновь отмывают клетки, высушивают препараты на воздухе и заключают в 50%-ный глицерин. Препараты исследу- .ют в люминесцентном микроскопе в отраженном свете при возбуждении люминесценции синефиолетовыми лучами (максимум пропускания 400 нм).
Взаимодействие МКА А-7 с клетками различных линий (число положительных клеток,%) представлено в табл. 1.
ОО
100 25,0-40,3
ОО
88 32,0-65,0
70 48,4-100
Линии клеток
Число положительных клеток, %
0
5
0
В-клеточные линии RPMI-1788
PHS Daudi .Namalva Raji Ramos,
Т-клеточные линии Molt-4 CCRF-HSB2 Jurkat
Ни-Т, ни В-клеточ- ная линия 5
10,0 20,0 95,0 82,0 27,0 О
О О О
О
30
35
. Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что МКА А-7 являются В-специфическими, т.е. взаимодействуют с мембранными антигенами В-клеточных линий, (за исключением линии Ramos),не реагируя с Т-клеточными линиями и К-562.
Взаимодействие МКА А-7 с клеткам крови в норме и при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях приведено в табл. 2.
Таблица 2
острым лимфобластным лейкозом
миеломной болезнью
Клетки лимфатических узлов больных лимфогранулематозом
: Результаты, представленные в ;табл. 2, свидетельствзшзт о том, что IB периферической крови здоровых люде ;от 11,5 до 29,4% клеток взаимодейст- ;вуют с МКА А-7. В костном мозге здор |вьк- лйдей до 40,3% клеток несут этот антиген. В то же время гранулоциты периферической крови и стромальные фибробласты костного мозга дают отрицательную реакцию. Только до 3,5% тимоцитов реагирует с МКА А-7. При Инфекционном мононуклеозе в перифе- рической крови число клеток, реаги- рующих с МКА, составляет около 5%, р абсолютном большинст.е случаев в |миндалинах при хроническом тонзиллит детей число Е-клеток, реагирующих МКА А-7, составляет от 32 до 65%,
Клетки, несущие антиген, выявляе- йый МКА А-7, обнаруживаются при зло- Качественных лимфопролиферативных ;заболеваниях, однако не во всех слу20,0-60,0 4,0-10,0
18,0-92,0
чаях. Так, клетки с этим антигеном присутствуют при хроническом лимфолей- кoзe в 70% случаев, при лимфогранулематозе - в 80% случаев, а при остром лимфобластном лейкозе у детей .- только в 20% случаев. При миеломной болезни единичные клетки несут этот антиген.
Таким образом, полученные ИКА А-7 взаимодействуют с дифференцировочным антигеном В-клеток человека, и могут быть использованы для диагностики лимфоидных форм лейкозов и лимфом.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток, животных Mus musculus ВСКК (II) № 77Д, используемый для получения моноклональных антител к диффе- ренцировочному антигену В-лимфоцитов человека.
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| Monoclonal antibody against a Burkitt lymphoma associated antigen | |||
| - Pros | |||
| Natl | |||
| Acad | |||
| Sci USA, 1981, 78, 10, 6485-6488. | |||
