Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител к лимфоидным лейкозам Т-клеточного ряда и Т-лимфоцитам человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при иммунологической диагностике острого и хронического лимфоидного лейкоза и изучении иммунологического статуса людей -.

Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностному антигену, присутствующему как на зрелых Т-лимфоцитах и тимоцитах здоровых лиц, лейкозных клетках больных острым лимфобластным лейкозом Т- типа, хроническими лифолейкоэами Т- и В-типов и Т-лимфом, так и на бластных клетках больных острым лимфо&ласт- ным лейкозом пре-Т-типа.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCA-16 (1F12) получен путем слияния клеток мышиной миеломы P3 X63-Ag8,653 с клетками селезенки мышей BAlB/c, иммунизированных лейкозными клетками больной хроническим лимфолейкоэом Т-типа. Сшивающий агент - полиэтилен- гликоль. Система селекции гибридных клеток - 3 клонирования.

Штамм депонирован в банке клеточных культур Института цитологии АН СССР под ригистрациокным номером

Јь ОО СО СО 4 С&

ВСКК(П) №129 D и характеризуется следующими признаками

Культуральные свойства„ Средой для культивирования кле- ток является RPMI-1640 или DMEM с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2% L-глутамина, 1% пирувата натрия, 0,1% гентамицииа и 10% кондиционной среды. Характер роста - стандартная суспензия. Метод снятия - встряхивание,- Частота пассирования 2-3 суток. Кратность рассева 1г20, Титр антител в культуральной жидкости Is 10.

Культивирование в организме леи- вотного

Развитие асцитной формы у мышей ВА1В/С происходит на 8-30 сутки. Титр антител в асцитной жидкости co-V ставляет 1;200„ .

Продуктивность штамма. Титр антител в культуральной среде 1:10 (в реакции непрямой имму- нофяюоресценции).

Характеристика полученного про- дукта. Штамм продуцирует моноклональ- ные антитела (МАТ) класса Ig GI к Т- лимфоцитам человека и лимфоидным лейкозам Т-клеточного ряда.

Консервация клеток,

Клетки штамма ВСА-16 () заморожены после первого и второго клонирований а также на каждом пассаже в культуре и после роста в виде асцитной опухоли мыши. Криозащитная среда - 40% ростовой среды (или RPMI- 1640), 50% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания} клетки в крио- защитной среде переносят в пластико- вые пробирки на 1 мл с крышкой и помещают на 1 сутки (18-24 ч) в холодильную установку при -70°С1) после чего переносят в жидкий азот Оттаивание производят при 37°С в течение 1,5 мин. Жизнеспособность клеток при размораживании составляет 70- 90%.

Сведения о контаминантах линии Бактерии, грибы, дрожжи и мико- плазма не обнаружены.

Пример 1. Исследование специфичности. Специфичность МКА в культуральной жидкости клеток гибридного штамма BCA-lb (1F12) и асцитной жидкости к антигенам мембран различных типок клеток определяют в микро- луночной модификации реакции непрямой иммунофлюоресценции. На первом

этапе реакции 1-2 х 105 живых клеток, прикрепленных к микролунке стекла или находящихся в микролунке микро- титраторной пластины, соединяют с 20-30 мкл культуральной жидкости или асцита в разведении 1:1.0-1:200 и инкубируют 30 мин при 0°С-с последующим двухкратным отмыванием. На втором этапе клетки соединяют с 20-. 30 мкл ФИТЦ-меченых козьих антител к Ig мыши. После 30 мин инкубации клетки дважды отмывают и результаты реакции оценивают с помощью флюорес- центнога микроскопа или прбточного цитофлюориметра. Реактивность МКА ВСА-16 (1F12) с различными клетками патологического и нормального лимфо- и миелопоэза представлена в табл.1 и 2. По результатам тестирования полученные МКА выявляют антиген, содержащийся на лейкозных клетках острых лимфобластных лейкозов пре-Т- и Т-ти пов, хронических лимфолейкозов Т- и В-типов и Т-лимфом, а также на мальных Т-лимфоцитах, тимоцитах и отсутствующий на клетках миелоидных лейкозов, зрелых моноцитах, нейтро- филах и В-клеточных линиях. Обнаружено, что МКА, продуцируемые штаммом BCA-lo (IF 12), обладают вариабельной комплемент - зависимой активностью по отношению к указанным выше анти- генсодержащим клеткам-мишеням.

I л1

II р и м е р 2. Определения класса иммуноглобулинов в полученных МКА ВСА-16 (1F12).

Класс и субкласс к. муноглобулинов мыши в полученных МКА определяют в иммуносорбентном методе энзиммеченых антител (ELISA) с использованием кроличьих антител против классов и субклассов иммуноглобулинов мышей и перок сидазмеченых козьих антител против иммуноглобулинов кроликов. Выявлено, что штамм гибридных клеток ВСА-16 (IF 12.) секретирует мышиные МКА класса Ig GI,

i

Таким образом, использование нового штамма мышиных гибридных клеток ВСА-16 (1F12), продуцирующего МКА к поверхностному антигену, присутствующему на клеткахчбольных острыми лим- фобпастными лейкозами пре-Т и Т-ти- пов, хроническими лимфолейкоэами Т- и В-типов и Т-лимфомами, а также на нормальных Т-лимфоцитах и тимоцитах

5U83946

и отсутствующему на клетках миелоид- ных лейкозов, зрелых моноцитах, нейт- рофилах н В-клеточных линиях, позволяет повысить информативность в иммунологической диагностике различных форм гемобластозов.

6 Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 129D - продуцент моноклоналъных антител к лимфоидным лейкозам Т-кле- точного ряда и Т-лимфоцигам человека.

Изобретение относится к био технологии и может быть использовано при иммунологической диагностике острого и хронического лимфоидного лейкоза и изучении иммунологического статуса пюдей. Цель изобретения получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (МАТ) к поверхностному антигену, присутствующему как На зрелых Т-лимфоцитах и тимоцитах здоровых лиц, лейкозных клетках больных острым лимфобластным лейкозом Т-тила, хроническими лимфолейкозами Т- и В-ти- пов и Т-лимфом, так и на бластных клетках больных острым лимфобллст- ным лейкозом пре-Т-типа. Штамм де- с понирован под номером ВСКК (П) №1290, Штамм продуцирует МАТ класса lg G I ,к Т-лимфоцитам человека и лимфоид- ным лейкозам Т-клеточного ряда в титре 1:10. 2 табл.

Таблица 1 Реактивность МКА ВСА-16 (1F12) к различным клеткам патологического лимфо- и миеолопоээа

Лейкозные клетки больных

Острыми лимфобластными

лейкозами:

пре-В-типа0/7

пре-1-типа2/5

Т-типа2/2

Хроническими лимфолейкоэами:

В-типа12/17

Т-супрессорного

типа2/4

Лимфомами:

В-типа1/2

Т-хелперного типа 5/6

Острыми миелобластньми

лейкозами0/15

Примечание: - реакция считается положительной при наличии свыше 25% ВСА-поло- жительных 1клеток;

- в числителе - число положительных случаев, в знаменателе - общее число обследованных больных.

Реактивность МКА

71483946 w8

Таблица 2/ Реактивность МКА ВСА-16 (1F12) к различным клеткам нормального лим- фо- и мнелопоэза

Клетки крови и клеточных линий

Лимфоциты крови70,,6

Моноциты кровиО

Нейтрофияы крови7,,3

Тимоциты- 66,,1 ФГА-активнровэнные

лимфоциты крови69,0±7,8 Клетки В-клеточных линий: ,

DandiО

Raji.О

Клетки миелоидной

линии К-562О

Примечание: собственные

данные, полу ченные при об- следовании JO до Но ров крови

Содержание ВСА-16 (1F12) -положительных клеток в популяции, % (М+м)