Способ идентификации фрагментов мембран хлоропластов Советский патент 1985 года по МПК G01N33/00 

СО

со ел

00

1

Изобретение относится к фотобиологии, а именно к способам идентификации фрагментов мембран хлоропластов для установления их происхождения из межгранных или гранальных тилакоидов, и мож.ет быть использовано при изучении механизма фотосинтеза растений.

Цель изобретения - ускорение идентификации и повышение точности анализа фрагментов мембран хлоропластов.

Способ осуществляется следующим образом.

Изолированные хлоропласты из листьев растений фрагментируют с помощью детергентов (например, дигитонина, тритона Х-100 и т.д.). Материал фрагментированных мембран хлоропластов фракционируют, например, дифференциальным центрифугированием. Полученные, в данном случае , в виде осадков фракции фрагментов мембран промывают в течение .2-3 ч при 2-3 сменами чистого (без детергента) фосфатного буфера, рН 7,0-8,0, что является достаточным для практически полного удаления детергента из осадка, тогд как однократная промывка недостаточна для этой цели.

После этого осадки фрагментов мембран фиксируют 1-3%-ным раствором глютароврго альдегида в течение 1-2 ч, постфиксируют 1-2%-ным раствором 0$0i, тоже в течение 1-2 ч, после чего обрабатывают 0,5-1%-ным раствором уранилацетата в течение 12-16 ч. Обработанный таким образом материал обезвоживают спиртом и ацетоном и заключают в эпон. Срезы залитых в эпоновые блоки осадков контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и просматривают под электронным микроскопом, устанавливая присутствие ил отсутствие частиц сопрягающего фактора на поверхности вторичных мембрноподобных структур.

Пример 1. Изолированные хлоропласты ячменя, фрагментируют 0,3%-ным раствором дигитонина в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 20 мин и фракционируют по.лученный материал с помощью дифференциального центрифугирования на фракции, осаждаемые при 20 тыс. в течение 30 мин, затем при

935802

.50 тыс. Ч в. течение 30 мин, при 100 тыс. С в течение 30 мин и при 144 тыс. (J, в течение 60 мин. Полученные осадки промывают в течение 3 ч тремя сменами (по 10 мл) чистого фосфатного буфера. Все перечисленные операции проводят при 0-4С. Отмытые от дигитонина осадки фиксируют 2%-ным глютаровым

О альдегидом в течение 1 ч, постфиксируют 2%-ным раствором OsOt, тоже в течение 1 ч, затем обрабатывают 1%-ным раствором уранилацетата в течение 12 ч, обезвоживают спиртом

15 и ацетоном и заключают в эпон. Срезы залитых в эпоновые блоки осадков прокрашивают 1%-ным раствором уранилацетата и цитратом свинца, . после чего их просматривают и фотографируют на электронном микроскопе, устанавливая присутствие или отсутствие структурных элементов

О

диаметром 100 А на поверхности вторичных мембраноподобных структур.

5 Пример 2. Материал обрабатывают аналогично примеру 1 за исключением того, что полученные осадки промывают одной сменой фосфатного буфера. Этого недостаточно

0 для формирования из фрагментов мембран четких мембраноподобных структур, т.е. на электронномикроскопических изображениях не видно четких мембраноподобных структур.

5 Пример 3. Материал обрабатывают таким же образом как в примере 1, за исключением того, что полученные осадки не промывают фосфатным буфером, а сразу фиксируют

0 глютаровым альдегидом. В этом случае вторичные мембраноподобные структуры из фрагментов мембран хлоропластов не образуются.

Пример 4. Материал обрабатывают таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что полученные осадки промывают фосфатным буфером, рН которого не 7,2, а 7,0. При таких условиях имеет место

0 образование вторичных мембраноподобных структур из фрагментов мембран хлоропластов.

Пример 5. Материал обрабатывают таким же образом как в примере 1, за исключением того, что

полученные осадки промывают фосфатным буфером, рН которого 8,0. При таких условиях наблюдается образо3 1193580

вание вторичных мембраноподобныхтилакоидах при прямом визуальном

структур, однако они имеют нескольконаблюдении (или фотографировании) под

нечеткий вид.электронным микроскопом.

Таким образом, предлагаемый спо-Причем вместо характерного для

соб обеспечивает достоверность ана-5 известного решения технически сложлиза фракций и значительно облегча-кого и сравнительно редкодоступного

ет его, так как позволяет определитьво многих лабораториях приготовлеисходную локализацию материала фраг-ния препаратов криоскалыванием исментированных мембран хлоропластовпользуют обычный метод ультратонв нативных межгранных и гранальных 0 ких срезов.

СПОСОБ ИДЕНтаФИКА1ЩИ ФРАГ-.. МЕНТОВ МЕМБРАН ХЛОР01ШАСТОВ, включающий фрагментирование мембран с помощью детергента, фракционирование и концентрирование анализируемых фрагментов, электронно-микроскопический анализ фракций, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения идентификации, сконцентрированные фрагменты промывают фосфатным буфером рН 7,0-8,0 для создания условий агрегации фрагментов мембран во вторичные мембраноподобные структуры, а идентификацию фрагментов осуществляют по присутствию на их поверхности частиц сопрягающего фактора.