СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОСТИ ИНФЕКЦИОННОГО ЭНДОКАРДИТА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/544 G01N33/48 

Изобретение относится к области кардиологии, в частности, к диагностике инфекционного эндокардита.

Инфекционный эндокардит (ИЭ) - инфекционное поражение клапанного и париетального эндокарда, эндотелиальной выстилки крупных магистральных сосудов, артерио-артериальных, артериовенозных шунтов. ИЭ относится к числу заболеваний с высоким риском смерти. Выбор технологии лечения во многом зависит от качества диагностики заболевания, в том числе - адекватной оценки активности патологического процесса (Harris R.J., Stone P.C.W., Hudson A.J. e.o., J. Clin. Pathol. , 1984, v. 37, p. 821). Морфологическим проявлением последней является деструктивный (язвенный, язвенно-некротический) процесс, приводящий к перфорации клапана и поражению подклапанных структур (Schafield К.Р., Youlgari F., Yozzard D.J. e.o., J. Clin. Pathol., 1982, v. 35, p. 866).

При высокой (3) степени активности процесса, проявляющегося язвенно-некротическим вальвулитом, необходима срочная замена пораженных клапанов и санация полостей сердца. При умеренной (2) степени активности у больных с тромбэндокардитом могут обсуждаться две альтернативные программы лечения: консервативная и хирургическая.

Минимальная (1) степень активности с продуктивным вальвулитом требует, как правило, консервативной тактики.

В клинической практике степень активности ИЭ устанавливается на основании совокупности косвенных критериев: наличия бактериемии, характера лихорадки, степени диспротеинемии, ускорения СОЭ. Перечисленные выше критерии обладают чрезвычайно низким уровнем специфичности для диагностики активности ИЭ (Harris R.J., Stone P.C.W., Hudson A.J. e.o., J. Clin. Pathol., 1984, v. 37, p. 821). Поиск параметров, характеризующих активность ИЭ, связан с изменением факторов повреждения эндотелиальной поверхности (Wadsnorth Ch. е.о., Journal of Immunological Methods., 1985, v. 83, p. 29). К числу важнейших гуморальных факторов, свидетельствующих о степени повреждения эндотелиальной поверхности, относится C-реактивный белок (СРБ) (Wadsnorth С., Scand. J. Immunol., 1983, v. 17, Suppl. 10, p. 71).

Исследование концентрации СРБ методом преципитации (осаждения) в капилляре не получило широкого распространения в клинической практике для верификации активности ИЭ из-за низкой чувствительности и малой специфичности метода (Wadsnorth C. Wadsnorth E., Clin. Chem. Acta, 1984, v. 138, p. 309). Для нужд клинической практики требуется разработать высоко специфичный метод количественного определения C-реактивного белка.

Предложен способ диагностики активности ИЭ путем иммунологического исследования крови для определения C-реактивного белка. Используют латексный диагностикум с иммуноглобулином, выделенным из высокоаффинной кроличьей антисыворотки к C-реактивному белку. Метод отличается высокой степенью специфичности. При обнаружении СРБ в крови больных инфекционным эндокардитом в количестве менее 20 мг% процесс расценивается как минимально активный (продуктивный вальвулит), при уровне 20-90 мг% - умеренно активный (язвенный тромбэндокардит), свыше 90 мг% - высоко активный (язвенно-некротический вальвулит). Метод прост и дешев, занимает не более 40 минут времени для выполнения.

Используется диагностикум латексный для обнаружения C-реактивного белка (Latex Diagnocticum for the delection of the C-reaction liquid). Представляет 1.5%-тую взвесь частиц монодисперсного полистирольного латекса с сорбированными иммуноглобулинами, выделенными из этой кроличьей антисыворотки к СРБ. Диагностикум представляет собой суспензию белого цвета; при хранении образуется два слоя: белый осадок, растворяющийся при взбалтывании, и прозрачная (или слегка опалесцирующая) надосадочная жидкость.

В присутствии СРБ происходит агглютинация частиц сенсибилизированного латекса в результате взаимодействия первого с соответствующим иммуноглобулином, находящимся на поверхности латексных частиц. Диагностикум используют в реакции агглютинации латекса (РАЛ) на стеклянных пластинках с сывороткой крови больных. Перед употреблением диагностикум выдерживают при комнатной температуре 10 минут, хорошо взбалтывают.

Для постановки реакции необходимо иметь:
1. Диагностикум латексный для обнаружения СРБ.

2. Контрольные сыворотки (сухие). Положительная сыворотка - пул сывороток больных, содержащих СРБ. Отрицательная контрольная сыворотка - пул сывороток, не содержащих СРБ.

3. Сыворотку крови больного.

4. Планшет для иммунологических реакций, стеклянные пластины, стеклянные палочки, дозаторы пипеточные и стеклянные пипетки.

5. Раствор для постановки РАЛ (глицино-солевой буферный раствор ph = 8.1±0.1). Состав раствора: глицин - 7.5 г; натрий хлористый - 10.0 г; бычий сывороточный альбумин - 1.0 г; дистиллированная вода до 1000.0 мл. Ph (8.1±0.1) устанавливают добавлением гидроокиси натрия в концентрации 5 Ммоль/л. Раствор фильтруют и хранят при температуре (6±2)^oC в течение недели. При необходимости более длительного хранения в него добавляют 0.9 г натрия оксида. Диагностикум для обнаружения СРБ контролируют с помощью РАЛ на специфическую активность (с положительной контрольной сывороткой), специфичность (с отрицательной контрольной сывороткой) и отсутствие спонтанной агглютинации. В ампулы с положительной и отрицательной контрольными сыворотками вносят 1.0 мл раствора для постановки РАЛ, готовят разведение 1:20. Пипеточным дозатором из ампулы с разведенными положительной и отрицательной контрольными сыворотками извлекают по 0.05 мл и наносят на 2 квадрата обезжиренной стеклянной пластинки, маркированной на квадраты размером 1.5x1.5 см. В третий квадрат пластины вносят 0.05 мл раствора для постановки РАЛ (для контроля на отсутствие спонтанной аглютинации). Во все три капли пипеточным дозатором добавляют по 0.02 мл диагностикума. После перемешивания капель стеклянными палочками пластины покачивают в течение 5-7 минут руками или на шуттеле, затем помещают во влажную камеру при 37^o±1^oC на 30-40 минут, после чего учитывают результат.

Учет результатов проводят визуально на темном фоне по 4- крестовой системе:
4+ четкая агглютинация частиц и образование белых скоплений; фон абсолютно прозрачный.

3+ большие и малые скопления частиц; фон прозрачный
2+ малые, но отчетливые скопления частиц; фон мутноватый
1+ слабая зернистая агглютинация на мутном фоне
0 агглютинация отсутствует; фон равномерно мутный
В квадрате с положительной контрольной сывороткой должна быть положительная РАЛ (не менее 3+). В квадрате с отрицательной контрольной сывороткой и раствором для постановки РАЛ должно быть полное отсутствие агглютинации (0).

Исследуемую сыворотку разводят раствором для постановки РАЛ и титруют с шагом 2 на обезжиренной стеклянной пластинке. Для этого на 6 квадратов пластинки добавляют 0.05 мл сыворотки в разведении 1:10, перемешивают и переносят в последние квадраты до разведения сыворотки 1:640. В каждую каплю сыворотки вносят 0.02 мл диагностикума, перемешивают стеклянными палочками, пластины покачивают стекло 5-7 минут руками или на шуттеле при (37±1)^oC на 30-40 минут, после чего учитывают результат.

Титром СРБ считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает РАЛ не менее 3+.

При учете результатов РАЛ следует обратить внимание на возможность отрицательных реакций в первых разведениях сыворотки из-за наличия прозоны. Определение концентрации СРБ в сыворотке проводили путем умножения максимального ее разведения (титр) на предельную чувствительность препарата, которую вычислили с референс-сывороткой с известным содержанием СРБ. Чувствительность препарата составила 270 нг/мл (0.27 мг%).

В качестве референс-сыворотки использовали сыворотку фирмы Bekman с известным содержанием СРБ (2.17 мг%), при этом титр латексного диагностикума с ней составил 1:80).

Примеры.

Больная С. , 42 лет, госпитализирована в терапевтическую клинику с диагнозом: Первичный инфекционный эндокардит аортального клапана (возбудитель - Staphylococcus aureus). По клинико-лабораторным данным активность процесса 2: фебрильная лихорадка без ознобов и потов; СОЭ - 30 мм/час; гамма-глобулины 23 объемных %; СРБ++ (преципитация в капилляре).

Реакция латексного диагностикума выявила СРБ в разведении 1:4000 (+++). СРБ - 0.27•4000 = 1080 мг%
При гистологическом исследовании клапана, удаленного во время операции протезирования, диагностирована высокая (3) степень активности процесса; язвенно-некротический вальвулит с перфорацией клапана.

Больной И. , 52 лет, госпитализирован в терапевтическую клинику с диагнозом: Первичный инфекционный эндокардит митрального клапана (возбудитель - Streptococcus faecalis). По клинико-лабораторным данным активность процесса 3: гектическая лихорадка с ознобами и потами; СОЭ - 60 мм/час; гамма-глобулины 34 об%, СРБ+ (преципитация в капилляре).

Реакция латексного диагностикума выявила СРБ в разведении 1:320(+++). СРБ - 0.27•320= 86.4 мг%. При гистологическом исследовании клапана, удаленного во время операции протезирования, установлена умеренная (2) степень активности процесса: рыхлые вегетации на створках митрального клапана; язвенный вальвулит.

Больной Б. , 36 лет, госпитализирован в терапевтическую клинику с диагнозом: Первичный инфекционный эндокардит аортального клапана (возбудитель - Streptococcus epidermidis). По клинико-лабораторным данным - активность процесса 3. Гектическая лихорадка с ознобами и профузными потами; СОЭ - 40 мм/час; гамма-глобулины 25 об%, СРБ++ (преципитация в капилляре). Реакция латексного диагностикума вывила СРБ в разведении 1:40(+++). СРБ - 0.27•40 = 10.8 мг%. При гистологическом исследовании клапана, удаленного во время протезирования, выявлен продуктивный вальвулит: с организованными вегетациями (активность процесса 1).

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики активности инфекционного эндокардита. Сущность способа заключается в определении концентрации С-реактивного белка с использованием латексного диагностикума, содержащего иммуноглобулин к С-реактивному белку, и при обнаружении концентрации в крови С-реактивного белка меньше 20 мг% процесс диагностируют, как минимально активный, при уровне 20-90 мг% -умеренно активный и свыше 90 мг% - высоко активный. Получаемые данные с высокой степенью точности диагностируют степень инфекционного процесса и коррелируют с данными гистологического исследования клапанов, извлеченных во время операции протезирования.

Способ диагностики активности инфекционного эндокардита путем иммунологического исследования крови для определенного С-реактивного белка (СРБ), отличающийся тем, что используют латексный диагностикум с иммуноглобулином, выделенным из высоко аффинной кроличьей антисыворотки к С-реактивному белку, при обнаружении СРБ в крови больных инфекционным эндокардитом меньше 20 мг% процесс диагностируют как минимально активный, при уровне 20-90 мг% - умеренно активный, свыше 90 мг% - высоко активный.