СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ СТРЕПТОДЕРМИЙ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время лечение пиококковых поражений кожи, в частности стрептодермии, является одной из актуальных проблем дерматологии. Широкий спектр имеющихся антибактериальных и иммунокорригирующих препаратов примерно в 10-15% случаев не могут обеспечить полного выздоровления и течение заболевания приобретает хронический характер, что приводит к временной потере трудоспособности и возможной инвалидизации (А.А.Каламкарян. Гнойничковые поражения кожи. М.: Медицина, 1984).

Резистентность организма к инфекциям во многом обусловлена активностью важнейших провоспалительных цитокинов (А.Ройт с соавт. Иммунология. М.: Мир, 2000) и факторами, влияющими на нее. По мнению ряда авторов (Л.В.Ковальчук, Л.В.Ганковская, Э.И.Рубакова. Система цитокинов. - М.: РГМУ, 1999), ведущее место в формировании как гуморального, так и клеточного антимикробного иммунитета принадлежит в основном фактору некроза опухолей-альфа (ФНОα) и гамма-интерферону (ИФ-γ). Их активность связана с интенсивностью течения воспалительного процесса. Что касается факторов, влияющих на их активность, то особый интерес может представлять изучение сывороточного содержания аутоантител (а-АТ) к данным цитокинам (идиотипов) и соответствующих антиидиотипических антител (АИАТ), т.е. антител, специфически связывающих вариабельные участки данных а-АТ (приведенная терминология несколько условна, т.к., строго говоря, АИАТ тоже являются аутоантителами).

В литературе есть указания на то, что сыворотка крови в норме содержит естественные физиологические а-АТ к ряду цитокинов, таким как ИЛ-1α, ИЛ-2, ФНОα. При ревматоидном артрите, при сепсисе уровень этих а-АТ повышается. Как правило, антитела к цитокинам тормозят действие цитокинов (М.А.Пальцев, А.А.Иванов, Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина, 1995). Нами не было обнаружено данных, касающихся изучения содержания а-АТ к цитокинам при пиодермиях. В целом же, количество публикаций, касающихся изучения содержания а-АТ к цитокинам in vivo, крайне невелико. Что же касается комплексного исследования равновесия системы идиотип-антиидиотип с направленностью к цитокинам, то таких исследований вообще не проводилось ни при пиодермиях, ни при какой-либо другой патологии.

В то же время такие исследования, в частности, при пиодермиях представляются нам весьма перспективными, особенно принимая во внимание теорию N.Jerne (Jerne N.K. The generative grammar of the immune system. Nobel Lecture, December 1984. - Bioscience Reports (Printed in Great Britain). - 1985. - Vol.5. - P.439-451), согласно которой иммунная система представлена в виде саморегулирующейся сети, состоящей из а-АТ и АИАТ с направленностью практически ко всем антигенам собственного организма. К тому же, если идиотипические а-АТ влияют, как уже было сказано, на активность цитокинов, то и АИАТ, связывающие эти а-АТ, тоже каким-то образом должны влиять на их активность, а тем самым и на клиническую картину самого заболевания.

Нами была создана тест-система, которую можно использовать для объективной оценки тяжести течения стрептококковых поражений кожи. С помощью данной тест-системы определяют уровень а-АТ к ФНОα (или его иммунохимическим аналогам) и уровень соответствующих специфических АИАТ.

В настоящее время оценку тяжести течения стрептококковых поражений кожи проводят с помощью анализа клинической картины заболевания, учитывая жалобы больного, площадь и характер пораженной поверхности (А.А.Каламкарян. Гнойничковые поражения кожи. М.: Медицина, 1984). В то же время выявляемые клинические признаки не всегда соответствуют истинной тяжести происходящих деструктивных процессов, что создает целый ряд сложностей для оптимальной тактики лечебных мероприятий.

Предлагаемый нами способ позволяет:

- оценивать сывороточный уровень а-АТ к ФНОα или их иммунохимическим аналогам;

- оценивать сывороточный уровень АИАТ к ФНОα или их иммунохимическим аналогам;

- по полученным данным определять степень тяжести стрептодермии.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа возможно повысить надежность оценки степени тяжести стрептодермии. Указанное осуществляется с помощью определения уровней а-АТ и АИАТ к ФНОα.

В результате такого обследования выявляются лица с патологически повышенными значениями уровней а-АТ и АИАТ к ФНОα, выходящими за границы эмпирически установленного диапазона нормы.

Реализация существенных признаков предлагаемого изобретения осуществляется следующим образом.

I. На планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) сорбируют ФНОα или его иммунохимические аналоги, например F(ab)₂-фрагменты специфических АИАТ к нему.

II. На планшеты для ИФА сорбируют антитела (идиотипические) к ФНОα или их вариабельные участки, например F(ab)₂-фрагменты.

III. На планшеты наносят образцы тестируемых сывороток и эталонной сыворотки.

IV. Выяляют связывающиеся из тестируемых сывороток антитела (идиотипические или антиидиотипические) с помощью конъюгатов антивидовых (вторичных) антител с ферментом, например пероксидазой хрена. Реакцию в лунках планшета проявляют субстратом, например о-фенилендиамином и Н₂О₂.

V. Обрабатывают полученные данные. Определяют интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые и эталонную сыворотки.

Не вытекает из известного уровня техники тот факт, что по значениям уровней а-АТ и АИАТ к ФНОα можно судить о тяжести стрептококкового поражения кожи.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ФНОα, АНТИТЕЛ К ФНОα

Получение F(ab)₂-фрагментов молекул АИАТ к ФНОα, т.е. его иммунохимических аналогов, проводили следующим образом. Кроликов породы "шиншилла" иммунизировали F(ab)₂-фрагментами поликлональных антител к ФНОα. Из получаемой антисыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными поликлональными антителами к ФНОα выделяли соответствующие АИАТ и в результате протеолитический обработки получали их F(ab)₂-фрагменты, которые использовали для активации планшет.

Для получения поликлональных антител к ФНОα использовали коммерческие препараты данного цитокина фирмы Sigma (США).

ПРОВЕДЕНИЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИФА

1. Растворы каждого из компонентов тест-системы (F(ab)₂-фрагменты идиотипических и антиидиотипических антител к ФНОα; вместо F(ab)₂-фрагментов АИАТ к ФНОα может быть использован сам ФНОα), диализованные против карбонатного буфера рН 9,2-9,8, вносят в отдельные лунки стандартных 96-луночных плоскодонных планшет для ИФА. Затем планшеты инкубируют 12-18 ч при температуре +2-4°С.

2. Удаляют (стряхиванием) из лунок растворы с несвязавшимися компонентами и (без дополнительной отмывки) заливают в них блокирующий буфер (например, 0.5% раствор желатина на 0.15 М NaCl). Инкубируют 1 час при 37°С.

3. Отмывают планшеты отмывочным буфером (с 0.05% твин-20).

4. Вносят на планшеты образцы тестируемых и эталонной сывороток в разведении 1:200 на отмывочном буфере. Инкубируют 12-18 ч при температуре +4°С.

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции осуществляют следующим образом. Раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антивидовыми антителами к IgG человека вносят во все лунки планшета. Затем планшеты инкубируют 60-90 мин при температуре +37°С или 12-16 ч при температуре +2-4°С, после чего коньюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером. Сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (например, 0.01-0.05% о-фенилендиамина с 0.001-0.005% перекиси водовода на 0.01-0.05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 10-20 мин при комнатной температуре.

7. По достижении оптимального уровня окрашивания реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М серной кислоты.

8. Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели.

9. Обрабатывают полученные данные.

а) Из двух дублирующих друг друга значений результатов реакции эталонной и тестируемых образцов сыворотки выбирают среднее.

б) Рассчитывают относительную интенсивность реакции с компонентами тест-системы тестировавшихся сывороток по отношению к реакции эталонной сыворотки (в процентах) по полученным значениям оптической плотности лунок.

10. Интерпретируют полученные данные.

В случае если значения уровней a-AT и АИАТ к ФНОα не превышают 145%, то в 86% случаев наблюдают легкое течение стрептодермии. Если значения уровней а-АТ и/или АИАТ к ФНОα превышают 145%, но составляют не более 175%, то в 74% случаев наблюдается течение стрептодермии средней тяжести. В том случае, если значения уровней а-АТ и/или АИАТ к ФНОα превышают 175%, то в 82% случаев наблюдается тяжелое течение стрептодермии с выраженным деструктивным процессом.

В качестве эталонной сыворотки брали пулированную сыворотку здоровых лиц от 16 до 50 лет.

Положительный эффект от реализации изобретения сводится к получению описанной тест-системы, с помощью которой можно объективно оценить тяжесть течения стрептококковых поражений кожи. Критерием оценки тяжести стрептококковых поражений кожи являются сывороточные уровни а-АТ и АИАТ к ФНОα.

При проведении анализа следует учитывать, что наличие различных сопутствующих заболеваний, в том числе инфекционных, эндокринных, может влиять на исследуемые параметры, что может привести к неточной интерпретации исследуемых показателей.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Пациент К., 36 лет. Болен в течение 3 лет. Весной и осенью появляются 3-5 фликтенелезных элемента на туловище на фоне субфебрильной температуры. Диагноз: стрептодермия.

Результаты тестирования:

Уровень а-АТ к ФНОα - 112; уровень АИАТ к ФНОα - 123.

Заключение: течение заболевания легкое.

Пример 2

Пациент З., 32 лет. В пахово-бедренных областях и межъягодичной складке большое количество сливающихся фликтен, которые быстро вскрываются, образуя сплошные эрозированные мокнущие поверхности ярко-розового цвета, с фестончатыми краями и бордюром отслаивающегося эпидермиса. Болен в течение 7 лет.

Диагноз - гидраденит (стафилодермия).

Результаты тестирования:

Уровень а-АТ к ФНОα - 144; уровень АИАТ к ФНОα - 154.

Заключение: течение заболевания средней тяжести.

Пример 3

Больной Ф., 39 лет. Болен в течение 4 лет. Заболевание началось с перифолли-кулярной пустулы с серозно-гнойным содержимым, быстро ссыхающимся в выпуклую корочку золотисто-желтого цвета. После ее отпадения обнаруживалась язва овальной формы с кровоточащим дном, покрытым грязно-серым налетом и мягкими отечными застойно-гиперемированными краями. Через 2-3 недели язва медленно заживала поверхностным рубцом, вокруг которого располагалась зона гиперпигментации. Процесс локализовался на голенях и коже бедер. Результаты тестирования:

Уровень а-АТ к ФНОα - 199; уровень АИАТ к ФНОα - 244.

Заключение: тяжелое течение заболевания.

ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ И СОЦИАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Применение диагностической тест-системы, с помощью которой определяют сывороточный уровень идиотипических и антиидиотипических антител к ФНОα, позволяет объективно оценивать степень тяжести стрептодермии. Это дает возможность клиницистам оптимизировать лечение стрептодермии.

Исследование проводится в лаборатории для иммуноферментного анализа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии, иммунохимии. Образцы сыворотки крови обследуемых тестируются с помощью иммуноферментного анализа на планшетах, покрытых сорбируемыми F(ab)₂-фрагментами идиотипических и антиидиотипических антител к ФНОα (вместо F(ab)₂-фрагментов АИАТ к ФНОα может быть использован сам ФНОα). При тестировании определяют уровни а-АТ и АИАТ к ФНОα. При этом если значения определяемых показателей не выходят за пределы 145% по отношению к реакции сыворотки, взятой за эталон, то течение стрептодермии расценивают как легкое; если значения одного или двух определяемых показателей превышают 145%, но составляют не более 175%, то течение стрептодермии расценивают как средней тяжести; если значения одного или двух определяемых показателей превышают 175%, то течение стрептодермии расценивают как тяжелое. Способ позволяет объективно оценить тяжесть течения стрептодермий.

Способ оценки тяжести течения стрептодермий, включающий забор крови, проведение клинико-биохимического исследования, отличающийся тем, что с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяют сывороточные уровни идиотипических и антиидиотипических антител к ФНОα, при этом, если значения определяемых показателей не выходят за пределы 145% по отношению к реакции сыворотки, взятой за эталон, то течение стрептодермии расценивают как легкое; если значения одного или двух определяемых показателей превышают 145%, но составляют не более 175%, то течение стрептодермии расценивают как средней тяжести; если значения одного или двух определяемых показателей превышают 175%, то течение стрептодермии расценивают как тяжелое.