ШТАММ БАКТЕРИЙ LEUCONOSTOC MESENTEROIDES - ПРОДУЦЕНТ АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА, СОДЕРЖАЩЕГО БЕЛОК Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K39/00 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Leuconostoc mesenteroides - как продуцирующего декстран, так и не продуцирующего его в зависимости от условий культивирования. Изобретение может быть использовано в производстве декстрановых препаратов и антигенного комплекса, содержащего белок, необходимого для выявления примесей в декстрановых препаратах, а также, впервые, используемого нами для определения уровня антител к недекстрановым примесям в сыворотках людей, которым назначено введение декстрановых кровезаменителей.

Известны антигенные белковые комплексы, полученные на основе микроорганизмов (1, 2).

Известен штамм бактерий Leuconostoc mesenteroides NRRL B512, используемый для выделения антигенного комплекса с целью выявления антигенных примесей в декстрановых препаратах (3). Однако антигенный комплекс не используется для определения уровня антител к макромолекулярным примесям в сыворотках людей, которым назначено введение декстрановых кровезаменителей. (Это определение необходимо, так как декстран, содержащий макромолекулярные примеси недекстрановой природы, может вызывать анафилактические реакции у людей, имеющих высокий уровень антител к недекстрановым примесям, в том числе и к белку). Однако, ни в России, ни за рубежом не осуществляются такие определения, главным образом, из-за отсутствия высокоактивного антигенного комплекса Leuconostoc mesenteroides, содержащего белок.

Задача изобретения - получение штамма бактерий Leuconostoc mesenteroides 05-19S, продуцирующего антигенный комплекс, содержащий белок, являющийся основой для получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к недекстрановым примесям в сыворотках человека, а также для получения высокоактивных кроличьих иммунных сывороток, используемых для определения примесей в декстрановых препаратах.

Штамм Leuconostoc mesenteroides 05-19S селекционирован из штамма Leuconostoc mesenteroides 05-19, полученного из коллекции НИИ кровезаменителей и медицинских препаратов МЗ РФ.

Для этого из отдельно выросших колоний на чашках Петри с 1,5% мясопептонным агаром (МПА) и 0,5% глюкозой отбирали колонии в S-форме. При изучении их в косопроходящем свете и с использованием бинокулярной лупы-микроскопа колонии должны быть мелкими, матовыми, зернистыми с ровными краями, с оранжево-зеленым и голубым свечениями.

В том случае, когда колонии отвечают описанным требованиям, проводят второй пассаж. Для этого типичные колонии в S-форме пересевают (по одной) в пробирки со скошенным 1,5% МПА с 0,5% глюкозы и инкубируют при 24^oC в течение 48 часов. Проверяют чистоту и морфологию выросших культур в мазках, окрашенных по Граму, а также путем посева культуры в среды Гисса.

Отобранные колонии штамма, типичные по всем показателям, смывают со скошенного агара сахарозо-желатиновой средой, разливают по ампулам и лиофильно высушивают. Штамм хранят в лиофильно-высушенном состоянии с сахарозо-желатиновым стабилизатором в ампулах в холодильнике при температуре 4-6^oC.

Штамм Leuconostoc mesenteroides 05-19S имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки. Мелкие грамотрицательные кокки, расположенные как поодиночке и попарно (25%), так и в виде цепочек (75%). При визуальном изучении выросших колоний на плотной среде - 1,5% МПА с 0,5% глюкозы в термостате при температуре 24^oC и при использовании бинокулярной лупы с естественным освещением можно видеть колонии в S-форме не более 2 мм в диаметре, матовые, зернистые, с ровными краями. Декстран визуально не определяется. При изучении колоний в косопроходящем искусственном освещении (угол наклона светового луча 45^o) с использованием бинокулярной лупы можно видеть, что колонии обладают оранжево-зеленым и голубым свечениями.

Рост штамма возможен на 1,5% МПА с сахарозой. При визуальном изучении выросшей на этой среде культуры наблюдается обильное образование декстрана в виде слизи.

Рост штамма возможен также на следующих питательных средах.

А. Полусинтетическая, г/л:
Калий хлористый - 0,10
Магний сернокислый - 0,10
Калий фосфорнокислый 1-замещенный - 1,00
Аммоний хлористый - 0,50
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный - 2,50
Соль Мора - 0,01
Парааминобензойная кислота или фолиевая кислота - 0,05
Пептон сухой ферментативный для бактериальных целей (от 14 до 15% азота) - 0,20
Дрожжевой автолизат - 0,001 дм³
Сахар-рафинад - 100,00 или 50,00 или 15,00 или
Глюкоза - 3,00
pH среды 6,6
Б. Синтетическая - солевой состав аналогичен составу питательной среды A, в которой пептон и дрожжевой автолизат заменены на 6 аминокислот.

Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. При культивировании штамма на средах, содержащих глюкозу, декстран не образуется. Синтез декстрана происходит при выращивании продуцента на средах, содержащих сахарозу, при этом идет выделение фермента декстран-сахарозы, катализирующего отщепление от сахарозы молекул глюкозы и последующий синтез декстрана с 1,6-глюкозидными связями по одноцепочному механизму без образования промежуточных соединений.

При выращивании штамма на средах Гисса культура ферментирует следующие сахара с образованием кислоты - ксилозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, глюкозу, салицин, искулин, галактозу, целлобиозу, инозит, маннит, трегалозу, не сбраживает - инулин, рамнозу, адонит, арабинозу, сорбит, крахмал.

Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот.

Генетической особенностью штамма является образование декстрана внеклеточно на средах, содержащих сахарозу.

Штамм не нуждается в витаминах.

Оптимальная температура роста штамма 24-25^oC. Рост возможен при pH среды от 6,2 до 7,2. Оптимум 7,0.

Штамм является факультативным анаэробом, оптимальной для роста является концентрация растворенного в среде кислорода - 5% от полного насыщения.

Из культуры L.mesenteroides предлагаемого штамма, выращенного в среде A, содержащей глюкозу, выделяли антигенный комплекс, содержащий белок.

Антигенную активность указанного комплекса определяли по активности кроличьих иммунных сывороток. В табл. 1 представлены данные реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) титрования сывороток, полученных при внутривенной и внутримышечной иммунизации кроликов антигенным комплексом предлагаемого штамма L.mesenteroides 05-19S, и кроличьих сывороток, полученных при внутримышечной иммунизации антигенным комплексом известного штамма L.mesenteroides NRRL B512 (3). В табл. 1а представлены данные РПГА при изучении сывороток, полученных только при внутримышечной иммунизации кроликов антигенными комплексами, выделенными из предлагаемого и известного штаммов. Из табл. 1 и 1а видно, что в этом тесте наблюдается высокая активность сывороток. Можно отметить, что уровни антител в сыворотках, полученных при иммунизации кроликов антигенным комплексом предложенного штамма L.mesenteroides 05-19S несколько выше уровней антител в сыворотках кроликов, иммунизированных антигенным комплексом, выделенным из известного штамма (302 и 358 против 224 и 224 соответственно).

Результаты реакции преципитации в геле по Оухтерлони, полученных нами антисывороток с антигенным комплексом, содержащим белок, также свидетельствуют с высокой активности предлагаемого штамма и получаемых на его основе сывороток.

Для определения антигенных примесей L.mesenteroides в образцах декстрана мы использовали полученные нами антисыворотки в тесте обратной радиальной иммунодиффузии (RSRI). Это позволило выявить антигенные контаминанты во всех изучаемых декстрановых препаратах.

Как уже отмечалось выше, декстрановые препараты, содержащие макромолекулярные примеси, в т.ч. белок, могут вызывать анафилактический шок у людей, получивших указанный декстран и имеющих высокие уровни антител к недекстрановым примесям. Из этого следует необходимость предварительного определения уровня антител к недекстрановым примесям в сыворотках людей, которым назначено переливание декстрановых кровезаменителей.

Антигенный комплекс, содержащий белок и не содержащий декстрана, выделенный нами из клеток предложенного штамма L.mesenteroides 05-19S, мы использовали для получения эритроцитарного диагностикума. С помощью указанного диагностикума в сыворотках людей нами впервые определены антитела к недекстрановым примесям.

В табл. 2 представлены данные титрования сывороток крови, полученных от 70 человек (взрослых и детей). Оказалось, что в сыворотках как взрослых, так и детей имеются разные уровни антител (от 0 до 64) к недекстрановым примесям L.mesenteroides.

Из табл. 2 видно, что в сыворотках крови детей высокие уровни антител (16-32) обнаружены у 16% этого контингента. В сыворотках крови взрослых высокие уровни антител (16-64) обнаружены у 23% людей. Это еще раз подтверждает, что предлагаемый штамм L.mesenteroides является продуцентом активного в антигенном отношении комплекса, который может использоваться в качестве основы для диагностикума для определения антител к недекстрановым примесям в сыворотках человека.

В зависимости от содержания источника углерода в среде штамм либо синтезирует декстран, либо не синтезирует. Декстранобразующую способность штамма определяли визуально и модифицированным нами спиртовым методом.

Синтез декстрана, продуцируемого L.mesenteroides штаммом 05-19S в культуральную жидкость, зависит от содержания сахарозы в среде и времени выращивания. В табл. 3 представлены данные накопления декстрана в культуральной жидкости в процессе выращивания предлагаемого штамма L.mesenteroides в полусинтетической среде (A) с содержанием сахарозы 15 г/л или 59 г/л. Из табл. 3 видно, что наибольший выход декстрана наблюдается в случае использования сахарозы в концентрации 50 г/л.

Выращивание предлагаемого штамма L.mesenteroides 05-19S для получения биомассы, содержащей декстран.

Пример 1. В производственную полусинтетическую питательную среду А, содержащую 50 г/л сахарозы, засевают инокулят штамма L. mesenteroides 05-19S, оптическая плотность которого равняется 0,13 Et. Инокулят получают смыванием с чашек Петри 20-36-часовой культуры, выросшей из лиофильно высушенной культуры на 1,5% МПА с 5% сахарозы, в затем пересеянной в пробирки с питательной средой A и сахарозой. Культуру выращивают в термостате при температуре 24^oC до 20-36 часов, до получения густой массы. После этого засевают в колбы. Культивирование в колбах проводят до 36-48 часов при температуре 24^oC на аппарате для встряхивания жидкостей при 100 колебаниях в минуту и амплитуду колебаний - 10. Исходный уровень pH должен быть 6,8-7,0, конечный - 5,0-6,2. По окончании выращивания бактерий содержание декстрана в культуральной жидкости, определяемое спиртовым методом и выраженное как оптическая плотность, должно быть 1,40-2,00 Et.

Хранение в лиофильно высушенном состоянии и использование предложенного штамма L.mesenteroides 05-19S позволяет получать биомассу L.mesenteroides со стабильными свойствами.

Пример 2. Выращивание предлагаемого штамма L.mesenteroides 05-19S для получения биомассы, не содержащей декстран, с целью последующего выделения из нее антигенного комплекса, содержащего белок.

Из ампулы с лиофильно высушенной культурой осуществляют посев штамма L. mesenteroides 05-19S на чашки Петри с 1,5% МПА и 0,5% глюкозой. Выросшую 20-36-часовую культуру при температуре 24^oC смывают с чашек и затем последовательно пересевают сначала во флаконы с производственной питательной средой A, содержащей глюкозу, а затем в колбы, далее в трехлитровые бутыли. Выращивание осуществляют при температуре 24^oC до 20-36 часов на аппарате для встряхивания жидкостей при 100 колебаниях в минуту, амплитуде колебаний - 10.

Оптическая плотность культуры, выросшей на последнем этапе приготовления инокулята в бутыли, должна быть 0,54 Et, pH = 6,6. Полученный инокулят в объеме 1,3 л засевают в биореактор, содержащий 2,7 л среды A и глюкозу.

В момент засева в биореактор оптическая плотность культуры должна соответствовать 0,18 Et, pH среды 7,1. Выращивание в биореакторе осуществляют при температуре 24^oC, при подаче воздуха - 0,5 л/мин и постепенном увеличении скорости вращения мешалки до 200 об/мин. Процесс культивирования заканчивают к 24-25 часам роста. Оптическая плотность культуры должна быть 0,87 Et, pH - 6,0.

Такие многочисленные пересевы и выращивания в среде, содержащей глюкозу, позволяют получить культуру, не синтезирующую декстран.

Полученные таким образом микробные клетки можно использовать для выделения антигенного комплекса, содержащего белок, применяемого для получения анти-L. mesenteroides иммунных кроличьих сывороток, имеющих более высокую серологическую активность по сравнению с известными сыворотками (табл. 1 и 1а). Полученные сыворотки можно применять в реакции обратной иммунодиффузии для определения следовых количеств примесей в декстрановых препаратах. Кроме того антигенный комплекс мы предлагаем использовать для получения эритроцитарного диагностикума с целью определения антител в сыворотках людей к антигенному комплексу L.mesenteroides, содержащему белок (табл. 2).

Штамм обладает уникальными свойствами, позволяющими использовать его либо как продуцент антигенного комплекса, содержащего белок, либо (при необходимости) как продуцент декстрана. Областями применения указанного комплекса можно варьировать, используя его как для обнаружения примесей в декстрановых препаратах, так и для определения антител к этим примесям в сыворотках людей, которым назначено введение кровезаменителей.

Источники информации
1. Семина И. Э. и др. Физико-химическая и биологическая характеристика антигенного комплекса, ЖМЭИ, 1988, N 8, с. 76-77.

2. SU 1708833 A1, 30.01.92.

3. Intern. Arch. of Allergy and Appl. Immunol., 1980, vol. 61, p. 457-466.

Предлагается новый штамм бактерий Leuconostoc mesenteroides N 05-19 S, продуцирующий антигенный комплекс, содержащий белок. Штамм депонирован в коллекции НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. Штамм можно использовать как продуцент антигенного комплекса или на некоторых средах как продуцент декстрана - основы производства кровезаменителей. Указанный антигенный комплекс может использоваться для получения: 1) диагностикума, который в свою очередь может применяться для определения антител в сыворотках людей к антигенному комплексу Leuconostoc mesenteroides, содержащий белок; 2) кроличьих анти-Leuconostoc mesenteroides -сывороток, необходимых в обратной радиальной иммунодиффузии для примесей Leuconostoc mesenteroides в декстрановых препаратах. 3 табл.

Штамм бактерий Leuconostoc mesenteroides НИИВС 05 - 19 S-продуцент антигенного комплекса, содержащего белок.