Способ получения биомассы менингококка Советский патент 1985 года по МПК C12N1/00 C12R1/36 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения биомассы менингококков, испольэуемой для приготовления диагностических препаратов. Известен способ получения биомассы менингококка для приготовления диагностических препаратов путем посева инокулята в питательную среду выращивания в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта тТ, Однако известный способ не обеспечивает высокой специфической активности диагностических препаратов Целью изобретения повышение специфической активности диагностических препаратов. Эта цель достигается тем, что согласно способу получения биомассы менингококка для приготовления диагностических препаратов путем посева инокулята в питательную среду, выращивания в условиях аэрации и перемешивания с последующим вьщелением целевого продукта, в качестве инокулята используют суспензию менингокок ка, образующего колонии в S-форме, перемешивание осуществляют со скоростью 50-100 об/мин в начале процес са с постепенным увеличением числа оборотов мешалки до 250-300 в минуту, а аэрацию проводят путем подачи воздуха со скоростью 10-20 л/|4ин в начале процесса с увеличением ее до 100-150 л/мин в конце процесса, при этом концентрацию растворенного в среде кислорода поддерживаю на уровне 10-20% от полного насыщения, и выделяют целевой продукт на стадии снижения удельной скорости роста от максимальньпс до 2/3 максимальных значений.. , П р и м е р 1. Штамм Neisseria meningitidis Be5 хранят в высушенном (СОСТОЯНИИ в ампулах, культуру для . jкоторых готовят из одной колонии, находящейся в &-форме. Культуру из ампулы засевают в чашки Петри на 1,5%-ный агар Хоттингера с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота и выращивают при в термостате в течение 18 ч в атмосфере СО, . . . Выросшую культуру (1-2 чашки) смывают физиологическим раствором при рН 7,0 и делают второй пассаж на чашки. Смыв культуры из второго пассажа засевают в ферментер с жидкой питательной средой, в которой в качестве источника азота взят казеиновый гид1ролизат с содержанием азота 150-160 мг%, в качестве источника углерода - крахмал растворимьй, в качестве минеральных солей КН.ГО , МоС1 , CuSO, хлориды, в качестве стимуляторов роста - цистеин, глютаминову;о кислоту и диализат дрожжей при следующем соотношении компонентов: казейновьй гидролизат из расчета в готовом продукте 150-160 мг% аминного азота, минеральные соли, г: KHj,PO 0,5; MgClj 0,4; GuSO 0,00125; цистеин .0,03; диализат дрожжей 100 мл; глютаминовая кислота 0,75 г; хлоридьг 0,8 г; крахмал растворимый 1,0 г; дистиллированная вода до 1,0 л./ Инокулят вносят из расчета 0,11,4 млрд клеток на 1 мл питатель.ной |среды. Выращивание в ферментере осуществляют при постоянном увеличении числа оборотов мешалки от 50 в минуту в начале процесса до 250 в Минуту в конце и подачи воздуха от 10 л в минуту в начале процесса до 100 л в минуту в конце, при этом концентрЕция растворенного в среде ки 1порода поддерживается на уровне не ниже 10% от полного насьш ения. Собирают целевой продукт - биомассу на стадии, при которой удельная скорость роста равна максимальной для данной среды величине, равной 1,0 ч. Биомассу собирают вместе с культуральной жидкостью в тот период, когда оптическая плотность популяции достигает 2 eд.Et. Фиксацию культуры для получения группоспецифических сывороток осуществляют путем однократного замораживания и последующего длительного хранения живой культуры нужной фазы развития при таОС; фиксацию культуры для реакции агглютинации на стекле осуществляют путем, лиофильного высушивания; фиксацию культуры для реакции преципитации в агаре и встречного электрофореза осуществляют путем действия мертиолята, сбора клеток центрифугированием, разрушения поверхностных слоев клеточной стенки щелочными эиачёниями рН и высушивания трехкратной обработкой ацетоном; иксацию культуры для приготовления эритроцитарных антигенных диагностикунов,осуществляют путем действия мертиолята, сбора клеток центрифугированием, разрушения полученной влаж ной массы ультразвуком, выделения растворимых антигенов-сенситинов. Пример 2, Посев культуры из ампулы на с сьшороточным ага ром, а затем пересев культуры второг пассажа с чашек в ферментёр с жидкой питательной средой осуществляется по примеру 1. Состав жидкой среды, г Казаминовые кислоты 10,0 Na HPO10,0 КС10,09. MogSO 7HjO0,06 Глюкоза .5,0 рН7,4 Выращивание в ферментере осуществ ляют при постепенном увеличении оборотов мешалки от too в минуту в начале процесса до 300 в минуту в конц и при подаче воздуха от 20 л в минуту в начале процесса до 150 л в конце. При этом концентрация растворенного в среде кислорода поддерживаетс на уровне 20% от полного насыщения, Собирают целевойпр1одукт - биомас су на стадии, при которой удельная скорость роста равна величине, составляющей 2/3 максимальной т.е. 0,66 ч . Биомассу собирают вместе с культурапьной жидкостью. Фиксацик) культуры осуществляют по примеру 1., Способ позволяет накопить биомассу, которая : 1ожет быть использована, для получения диагностических сьюороТок, и других диагностических препаратов. После иммунизации кроликов этой биомассой по общепринятой получены менингококковые сывърот. /. - -ки, отличаюп№1еся высокой групповой специфичностью, стандартностью, активностью. Данные приведены в табл. 1 и 2./ О возможности использовать биомассу, полученную предлагаемым способом, в качестве антигена в реакции микропреципйтации в агаре свидетельствуют следующие результаты. После сбора биомассы, центрифугирования и доведения до 50 ед. мутности ее подвергают действию раствора мертиолата 1:10000 и щелочных значении рН ,2 в течение . Результаты микро преципитации этой биомассы с Соответствующими сьгооротками представлены в табл.3. Использование способа позволяет получать биомассу менингококка серогруппы В, .обладающую высокой ri ynповой специфичностью, сыворотки, полученные против этой биомассы, помимо высокой групповой специфичности, обладают высокой чувствительностью, Ч;то улучшает диагностику. Для сенсибилизации эритроцитов с целью получения ультразвукового эритроцитарного диагностикума, дающего одной силы реакцию, требуется в 200 раз меньшее количество биомассы, полученной предлагаемый способом Кроме того, разработанная технология приготовления диагностических сывороток, включающая фиксацию биомассы замораживанием, позволяет в 30-40 раз сократить времяI идущее на выращивание культуры и стабштзовать свойства биомассы и получаеьых из нее .сьгаороток. Т а б л и ц а 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МЕНИНГОКОККА ДЛЯ приготовления диагностических препаратов путем посева инокулята в питательную среду. выращивания в условиях аэрации и перемешивания с последуюпщм вь1делением целевого продукта, отличающийся тем, 4Td, с целью повышения специфической активности диагностических препаратов, в качестве инокулятаиспользуют суспензию менингококка, образующего колонии в S-форме, перемешивание осуществляют со скоростью 50-100 об/мин в начале процесса с постепенным увеличением числа оборотов мешалки до 250-300 в минуту, а аэрацию проводят путем подачи воздуха со скоростью 1020 л/мин в начале процесса с увеличением ее до 100-150 л/мин в конце процесса, при этом концентрацию раст л воренного в среде кислорода поддерживают на уровне 10-20% от полного насыщения, и вьщеляют целевой продукт на стадии снижения удельной скорости роста от максимальных до 2/3 макс 1альиых значений. СП Р со 4: 00

гетерологичной серогруппы А-208 ч

серогруппы С-0638