СИНТЕТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве синтетических питательных сред для выращивания бруцелл, а также в микробиологических, биохимических и генетических исследованиях.

Являясь паразитирующими в органах и тканях человека и животных микробами, бруцеллы требовательны к составу питательных сред.

К настоящему времени известно несколько вариантов синтетических питательных сред, обеспечивающих рост бруцелл трех классических видов или какого-либо одного из них. Обязательными компонентами таких сред являются источники углерода, минеральные соли, источники азота - аминокислоты, стимуляторы роста - витамины.

Известны исследования влияния на рост бруцелл видов B.melitensis, B. abortus, B. suis различных аминокислот и витаминов (Кондратьева О.В., Степанов В. И. "К изучению питательных потребностей бруцелл" Сообщ. 1 // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций. - Саратов, 1968. - С. 335-336; Кондратьева О. В., Степанов В.И. "К изучению питательных потребностей бруцелл" Сообщ. 2// Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 1969. - С. 154-155).

За основу среды была принята среда "А" Д. Ледерберга, включающая глюкозу 1 г/л, двузамещенный фосфорнокислый калий 7 г/л, однозамещенный фосфорнокислый калий 2 г/л, цитрат натрия 0,5 г/л, сернокислый магний 0,1 г/л, сернокислый аммоний 1 г/л. Для уплотнения плотной среды добавляется агар-агар.

К основе "А", которая сама по себе не обеспечивает рост бруцелл, добавляли различные аминокислоты и витамины и исследовали их влияние на рост бруцелл трех видов. Аминокислоты брали в концентрации 0,001 - 0,005 мг/мл, витамины B₁, B₂, B₆, B₁₂ - 0,2 мг/мл, биотин - 0,0001 мг/мл.

Исследования показали, что синтетическая среда "А" при добавлении 6 аминокислот (глутаминовая кислота, α-аланин, лизин, гистидин, метионин, цистеин) обеспечивает рост всех исследуемых видов бруцелл. В то же время B. melitensis, B.abortus, B.suis существенно отличаются между собой по характеру питательных потребностей. Наиболее требовательными к аминокислотному составу являются штаммы B.melitensis. B.abortus хорошо росли только в присутствии цистеина, часть штаммов - при замене цистеина глутаминовой кислотой. Для B. suis обязательно присутствие цистеина. Наиболее выраженное положительное влияние на рост бруцелл оказывали витамины B₁, B₂, B₆, B₁₂ и биотин.

Результаты исследований обуславливают необходимость разработки оптимального состава среды, обеспечивающего рост всех видов и биоваров бруцелл с учетом их питательных потребностей.

Наиболее близкой по составу и назначению является синтетическая питательная среды для выращивания бруцелл (А.С. N 933702, C 12 N 1/20, 07.06.82, Бюл. N 21). Среда содержит агар-агар, источник углерода - натрий пировиноградокислый, аминокислоты - L-метионин, L-аспарагин, витамины - никотиновую кислоту, кальция пантотенат, биотин, минеральные соли - калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий хлористый, натрий сернистокислый, аммоний хлористый и воду при следующем соотношении компонентов, г/л:
Агар - 14,0 - 16,0
Натрий пировиноградокислый - 0,9 - 1,1
L-Метионин - 0,02 - 0,03
L-Аспарагин - 0,09 - 0,11
Никотиновая кислота - 1,5 - 2,5•10^-4
Кальция пантотенат - 1,5-2,5•10^-4
Биотин - 0,5-1,5•10^-7
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5 - 2,9
Натрий хлористый - 7,3 -7,7
Натрий сернистокислый - 0,09 - 0,11
Аммоний хлористый - 0,9 - 1,1
Данная среда обеспечивает рост 32 штаммов 6 видов бруцелл. Использование этой среды позволяет при одинаковых ростовых условиях изучать влияние различных дополнительных компонентов (мутагены, антибиотики и т.д.) на биологические свойства, в частности на питательные потребности бруцелл.

Однако среда не обеспечивает в достаточной степени питательные потребности ряда штаммов, что отражается на выходе выращиваемой биомассы и затрудняет проведение микробиологических, биохимических и генетических исследований.

Целью изобретения является разработка рецептуры питательной среды, обеспечивающей питательные потребности всех известных видов и биоваров бруцелл и увеличение выходов выращиваемой биомассы.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда содержит агар-агар, в качестве углеродсодержащего компонента - глюкозу, в качестве минеральных солей - калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, аммоний сернокислый, натрий лимоннокислый, в качестве аминокислот - глутаминовую кислоту, цистеин, лизин, гистидин, аланин и метионин, в качестве витаминов - тиамин, никотиновую кислоту, пантотенат кальция, биотин, рибофлавин и пиридоксин при следующем соотношении компонентов, г/л:
Агар-агар - 14,0 - 16,0
Глюкоза - 1,0
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 7,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0
Натрий лимоннокислый - 0,5
Магний сернокислый - 0,1
Аммоний сернокислый - 1,0
L-Глутаминовая кислота - 0,5 - 1,5
L-Цистеин - 0,025-0,05
L-Лизин - 0,025 - 0,05
L-Гистидин - 0,025 - 0,05
L-Аланин - 0,025 - 0,05
L-Метионин - 0,025 - 0,05
Тиамин - 0,0002
Никотиновая кислота - 0,0002
Пантотенат кальция - 0,0002
Рибофлавин - 0,0002
Пиридоксин - 0,0002
Биотин - 0,0000001
По отношению к прототипу заявляемая питательная среда имеет следующие отличительные признаки. Использование глюкозы в качестве углеродсодержащего компонента в совокупности с дополнительным введением калия фосфорнокислого двузамещенного, магния сернокислого, аммония сернокислого, глутаминовой кислоты, цистеина, лизина, гистидина, аланина, рибофлавина, тиамина, пиридоксина обеспечивает питательные потребности и достаточный рост широкого набора штаммов бруцелл всех известных видов, в том числе и вакцинных, по сравнению с прототипом, а также увеличивает выход выращиваемой биомассы.

Возможность практического использования изобретения иллюстрируется конкретным выполнением заявляемой рецептуры.

Пример 1. Готовят среду следующего состава, г/л: глюкоза - 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный - 7,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0; натрий лимоннокислый - 0,5; магний сернокислый - 0,1; аммоний сернокислый - 1,0; L-глутаминовая кислота - 1,0; L-цистеин - 0,03; L-лизин - 0,03; L-гистидин - 0,03; L-аланин - 0,03; L-метионин - 0,03; никотиновая кислота - 0,0002; тиамин - 0,0002; пантотенат кальция - 0,0002; рибофлавин - 0,0002; пиридоксин - 0,0002; биотин - 0,0000001; и вода дистиллированная - 1000 мл. Среду нагревают при непрерывном помешивании до полного растворения ее компонентов. Для придания плотности вносят агар-агар в количестве 15 г и стерилизуют на водяной бане при 100^oC в течение 30 мин. Готовую среду разливают в пробирки по 5 мл и скашивают или в чашки Петри по 25-30 мл. После застывания и подсушивания среду используют в течение 7-15 дней при условии хранения в холодильнике. Плотная среда прозрачная, что позволяет четко наблюдать морфологию колоний. Испытуемые культуры бруцелл выращивают на 2% агаре Альбими, pH 7,2, при температуре 37^oC в течение 48 ч. На пластинки агара засевают одну бактериологическую петлю диаметром 2 мм, взвеси в физиологическом растворе двухсуточной агаровой культуры густотой 10⁶ м.к./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича 10 ЕД. Посевы инкубируют в термостате при 37^oC. Наличие роста регистрируют визуально через 48-72 ч.

Всего изучение 37 штаммов бруцелл шести известных видов - из них 5 штаммов - B. melitensis, 10 - B.abortus, 17 - B.suis, 2 - B. neotomae, 2 - B. ovis, 1 - B.canis. В таблице приведены данные роста бруцелл различных видов на предлагаемой питательной среде.

Результаты испытания ростовых качеств предлагаемой среды показывают, что на среде растут все испытанные штаммы бруцелл различных видов с сохранением типичной морфологии бруцеллезных колоний.

Пример 2. При необходимости использования жидкой синтетической питательной среды готовят среду следующего состава, г/л: глюкоза - 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный - 7,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0; натрий лимоннокислый - 0,5; магний сернокислый - 0,1; аммоний сернокислый - 1,0; L-глутаминовая кислота - 1,0; L-цистеин - 0,03; L-лизин - 0,03; L-гистидин - 0,03; L-аланин - 0,03; L-метионин - 0,03; никотиновая кислота - 0,0002; тиамин - 0,0002; пантотенат кальция - 0,0002; рибофлавин - 0,0002; пиридоксин - 0,0002; биотин - 0,0000001 и вода дистиллированная - 1000 мл. Среду нагревают при непрерывном помешивании до полного растворения ее компонентов и стерилизуют на водяной бане при 100^oC в течение 30 мин. Готовую среду разливают в пробирки по 10 мл и засевают в них по 0,1 мл взвеси в физиологическом растворе двухсуточных агаровых культур исследуемых штаммов бруцелл различных видов концентраций 1•10⁹ м.к./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Посевная доза при этом составляет 1•10⁷ м. к./мл. Учет результатов проводят ежедневно, определяя концентрацию микробных клеток по оптической плотности бактерий при помощи фотоэлектроколориметра (ФЭК-60 Н).

Максимальная конечная концентрация бактерий обычно достигается на 5-7 сут выращивания и составляет величины порядка 0,5-2 • 10⁹ м.к./мл, в зависимости от вида и штамма бруцеллезных бактерий.

Предельные концентрации компонентов среды оптимально необходимы и достаточны для обеспечения достаточного роста и выхода биомассы представителей шести видов бруцелл. Содержание агар-агара, минеральных солей, углеродсодержащего компонента соответствует классической рецептуре Д.Ледерберга, минимальное содержание аминокислот и витаминов превышают значения у среды по прототипу, увеличения же их концентрации нецелесообразно, т.к. улучшения ростовых свойств среды не происходит.

Таким образом, заявляемая синтетическая среда практически осуществима, применение предлагаемой питательной среды позволяет получить достаточный рост и выход биомассы представителей всех известных видов бруцелл.

Изобретение предназначено для культивирования бруцелл. В состав питательной среды входят минеральные соли, углеродсодержащий компонент, аминокислоты, витамины при следующем содержании г/л: агар-агар 14,0 - 16,0, глюкоза 1,0, калий фосфорнокислый двузамещенный 7,0, калий фосфорнокислый однозамещенный 2,0, натрий лимоннокислый 0,5, магний сернокислый 0,1, аммоний сернокислый 1,0, L-глутаминовая кислота 0,5 - 1,5, L-цистеин 0,025 - 0,05, L-лизин 0,025 - 0,05, L-гистидин 0,025 - 0,05, L-аланин 0,025 - 0,05, L-метионин 0,025 - 0,05, тиамин 0,0002, никотиновая кислота 0,0002, пантотенат кальция 0,0002, рибофлавин 0,0002, пиридоксин 0,0002, биотин 0,0000001, вода до 1 л. Среда обеспечивает питательные потребности всех известных видов и биоваров бруцелл и увеличивает выход выращиваемой биомассы. 1 табл.

Синтетическая питательная среда для выращивания бруцелл, содержащая агар-агар, углеродсодержащий компонент, минеральные соли - калий фосфорнокислый однозамещенный, аминокислоты - метионин, витамины - никотиновую кислоту, пантотенат кальция, биотин, отличающаяся тем, что она в качестве источника углерода содержит глюкозу, дополнительно содержит минеральные соли - калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, аммоний сернокислый, натрий лимоннокислый, аминокислоты - L-глутаминовую кислоту, L-лизин, L-цистеин, L-гистидин, L-аланин, витамины - тиамин, рибофлавин, пиридоксин при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:
Агар-агар - 14,0 - 16,0
Глюкоза - 1,0
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 7,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0
Натрий лимоннокислый - 0,5
Магний сернокислый - 0,1
Аммоний сернокислый - 1,0
L-Глутаминовая кислота - 0,5 - 1,5
L-Цистеин - 0,025 - 0,05
L-Лизин - 0,025 - 0,05
L-Гистидин - 0,025 - 0,05
L-Аланин - 0,025 - 0,05
L-Метионин - 0,025 - 0,05
Тиамин - 0,0002
Никотиновая кислота - 0,0002
Пантотенат кальция - 0,0002
Рибофлавин - 0,0002
Пиридоксин - 0,0002
Биотин - 0,0000001