Питательная среда для выращивания туляремийного микроба Советский патент 1983 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и касается синтетических питательных сред для выращивания туляремийного микроба. Известна питательная среда для выращивания туляремийного микроба кровяной глюкозо-цистиновый ПИ1 ательный агар Д ЮОднако на этой питательной среде не всегда возможно проводить мно гие бактериологические, генетические и биохимические исследования туляремийного микроба. Наиболее близкой к изобретению яв ляется питательная среда для выращив ния туляремийного микроба, содержаща 1-аргинин НС1 , 1-цистеин НС1, 1-гист дин НС1 , dl-изолейцин, 1-лейцин, 1лизин НС1, dl-метионин, 1-пролин, dl-треонин, 1-тирозин, 1-валин, ., HaCl, MgSO 7H20 соль фосфорной кислоты, тиамин, глюкозу и ди тиллированную воду С 1 Однако на известной питательной среде невозможно получить рост широкого круга туляремийных микробов. Целью изобретения является уни цирование среды. Цель достигается тем, что пита тельная среда для выращивания тул мийного микроба, содержащая 1-арг НС1, 1-цистеин НС1 .1-гистидин НС dl-изолейцин, 1-лейцин, 1-лизин Н dl-метионин, 1-пролин, dl-треонин 1-тирозин, 1-валин, KUgPO, NaCI, MgSO -7H/jO, соль фосфорной кисло ты, тиамин, глюкозу и дистиллиров ную воду, дополнительно содержит тотенат кальция, в качестве соли форной кислоты она содержит Ма„НР при следующем количественном соот шении компонентов, г/л дистиллиро ванной воды: 0,15-0,25 1-Аргинин НС1 1,3-1,7 1-Цистеин НС1 1,8-2,2 1-Гистидин НС1 dl-Изолейцин 0,12-0,17 0,35-0, -Лейцин 0,33-0,its -Лизин НС1 0,,55 d -Метионин -Пролин 0,9-1,1 -Треонин 1,9-2,1 0,15-0,25 -Тирозин 0,75-0,85 -Валин 2,6-3,1 КНгРО ,5-5,5 MgSO..- 71-LO 0,03-0,05 1,5-1,8 NajHPO Тиамин0,015-0,025 Пантотенат кальция0,,06 Глюкоза . 14,0-16,0 Готовят питательную среду следующим образом. П р и.м е р 1, Берут 1,5 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na,jHPO.) и в него заливают 375 мл дистиллированной воды. Эту смесь подогревают на водяной бане до и перемешивают до полного растворения. Затем 2,6 г рднозамещенного фосфорнокислого калия (КНяРО.) заливают 625 мл дистиллированной воды, эту смесь подогревают на водяной бане до иперемешивают до полного растворения. Затем растворы фосфорнокислых солей объединяют, добавляя к натриевой соли соль калия, при этом образуется калиево-натриевый фосфатный буфер, рН -6,6, который является основой для получения жидкой питательной синтетической средЫо Для получеНИЯ плотной синтетической питательной среды в калиево-натриевый фосфатный буфер добавляют 10-15 г/л агар-агара о Агар-агар вносят в полученный калиево-натриевый фосфатный буфер и расплавляют его на кипящей водяной бане (100°С) в течение 20 мин. Затем отвешивают аминокислоты, г: 1-Аргинин НС1 0,15 1-Цистеин нее 1,3 1-Гистидин 1,8 dI-Изолейцин 0,24 1-Лейцин0,35 1-Лизин НС 1 0,35 dl-Метионин 0,9 I-Пролин0,9 dl-Треонин 3,8 1-Валин0,75 Каждую из навесок аминокислот растворяют поочередно в 10 мл приготовленного ранее калиево-натриевого фосфатного буфера, нагревают до 90°С с помешиванием до полного растворения, сливают в одну емкость объемом более Тли перемешивают Затем к 0,15 г 1-тирозина добавляют -J: мл 1 н. едкого натра (NaOH), после«этого к навеске 1-тиродина с 1 н. едким натром добавляют 40 мл приготовленного ранее фосфатного буфера, нагревают до 90°С при помешивании и сразу же после его растворения сливают в емкость со смесью аминокислот. Потом растворяют k,S г хлористо,го натрия (NaCl) в 20 мл фосфатного буфера при нагревании до 70°С и помешивании, затем 0,03 г сернокисло го магния (MgSO), 0,015 г тиамина, 0,04 г пантотената кальция - каждую из навесок растворяют в 2 мл дистиллированной воды при нагревании до и помешивании. Растворенные компоненты добавляют поочередно с по мешиванием к смеси растворов аминокислот. После этого объем среды доводят до 1 л приготовленным ранее фосфатным буфером и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 0,5 атм. Затем готовят раствор глюкозы Для этого берут 1,0 г глюкозы, растворяют в iO мл дистиллированной воды и стерилизуют в автоклаве при режиме 1 атм в течение $ мин. П р им ер 2. Берут 1,8 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (), заливают 375 мл дистиллированной воды и эту смесь подогревают на водяной бане до и перемеши.вают до полного растворения. Затем 3,1 г однозамещенного фосфорнокислого калия () заливают 625 мл дистиллированной воды, эту смесь подогревают на водяной бане до 70°С и перемешивают до полного растворения. Затем растворы фосфорнокислых солей объединяют, образуя калиево-на риевый фосфатньТй буфер, рН -6,6. Для получения плотной синтетической сред применяют агар-агары. Агар-агары вно сят в полученный калиево-натриевый фосфатный буфер рН-6,6 и расплавл ют на кипящей водяной бане () в течение 20 мин. Затем отвешивают аминокислоты, г: 1-Аргинин НС1 1-Цистеин НС1 1-Гистидин dl-Изолейцин 1-Лейцин 1-Лизин НС1 dl-Метионин 1,1 . 1-Пролин dl-Треонин 1-Валин0,85 Каждую из навесок аминокислот ра створяют в АО мл приготовленного ра нее калиево-натриевого фосфатного б фера при нагревании до 90°С с помешиванием до полного растворения и 1 0 объемом босливают в одну емкость лее 1 л. Затем к 0,25 г 1-тирозина добавляют 2 мл 1 н. едкого натра, после этого к навеске 1-тирозина с 1 н. едким натрием добавляют kO мл приготовленного ранее фосфатного буфера, нагревают до 90°С при помешивании и сразу же после его растворения сливают в емкость со смесью аминокислот. Потом растворяют 5,5 г хлористого натрия в 20 мл фосфатного буфера при нагревании до и помешивании, затем отвешивают 0,05 г сернокислого магния (МдБОд) 0,025 г тиамина, 0,06 г пантотената калия каждый растворяют в 2 мл дистиллированной воды при нагревании до 70°С и помешивании. Растворенные компо- . ненты добавляют поочереднб с помешиванием к смеси растворов аминокислот. После этого объем среды доводят до 1 л приготовленным ранее фосфатным буфером и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 0,5 атм (l10j8°C). Затем готовят раствор глюкозы. Для этого 16,0 г глюкозы растворяют в АО мл дистил-. лированной воды и стерилизуют в автоклаве в течение 5 мин при 1 атм. Стерилизованную питательную среду и раствор глюкозы хранят разделСно в холодильнике при до использования.. Срок хранения.до 60 сут. Предлагаемую питательную среду используют следующим образом, о Перед посевом берут жидкую среду и в нее вносят АО мл приготовленного 35 или АО -ного раствора глюкозы, в зависимости от концентрации компонентов по граничным пределам. Затем разлива-от во флаконы или колбы по 1050 мл. В отличие от известной жидкой питательной среды выращивание на предлагаемой жидкой среде проводят без принудительной аэрации. Если посевы проводить на плотную питательную среду, то ее предварительно расплавляют на водяной бане, затем в нее вносят АО мл 35 АО -ного раствора глюкозы и перемешивают. После это го среду разливают в пробирки по 5 мл и скашивают или в чашки Петри по ZS 30 мл. Посев производят на застывшие агаровые поверхности. Плотная среда прозрачная, что позволяет четко наблюдать Аорфологию колонии. . |1редложенная питательная среда . , позволяет обеспечить стабильный и до$1статочный рост туляремийного микроба ( м к/мл среды ) по оптическому стандарту мутности ТИСХ (кишечному Выход бактерий на жидкой среде получают на 3 порядка выше посевной дозы, а также получают и сплошной рост на плотной среде. Предлагаемая питательная среда обеспечивает достаточный рост нсследованных штампов туляремийного микроба, представляющих все известные раз 706новидности этого возбудителя - голарктическую, неарктичёскую и среднеазиатскую расы. Рост, всех рас туляремийного микроба на предлагаемой среде позволяет изучать его свойства на более высоком уровне, а именно таких как особенности неготипа, путей метаболизма, активности ряда ферментов, знание этих свойств имеет практ1.|Ческое значение для борьбы с этой инфекцией

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА, содержащая 1 -аргинин НС1, 1-цистен НС1, 1-гистидин НС1, dl-изoлeйцин,l-лейцин, (й -лизин HCl, dl-метионин, 1-пролин, dl-треонин, 1-тирозин, Т-валин, , NaCl, MgSO,. , соль фосфорной кислоты, тиамин, глюкозу и дистиллированную йоду, отличают а я с я тем, что, с целью унифицирования среды, она дополнительно содержит пантотенат кальция, в качестве соли фосфорной кислоты она содержит при следующем количественном соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: 1-Аргинин НС10,15-0,25 1-Цистеин НС11,3-1,7 1-Гистидин НС11,8-2,2 dl-Изолейцин0,12-0,17 0,35-0,5 1-Лейцин 0,35-0, 1-Лизин НС1 0,,55 d1-Метионин 0,9-1,1 1-Пролин i dl-Треонин 1.9-2,1 0,15-0,25 I-Тирозин 0,75-0,85 1-Валин 2,6-3,1 КНуРО. Natr 1,5-5,5 0,03-0,05 MgS04-7H,,0 1,5-1.8 Хиамин СО,О15-0,025 Пантотенат 0,04-0., 06 СО 4ib кальция :1A,0-16,0 Глюкоза