СПОСОБ РЕПРОДУКЦИИ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО БАКТЕРИОФАГА Российский патент 2005 года по МПК C12N7/00 C12N1/20 C12N7/00 C12R1/92 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в технологии репродукции бруцеллезных бактериофагов.

Известен способ получения бруцеллезного бактериофага Bk2, при котором готовят 5-ти часовую бульонную культуру штамма-размножения конечной концентрации 1×10⁹ м.к./мл. В 3 мл полужидкого (0,7%) агара Альбими, охлажденного до 56°С, вносят 0,1 мл культуры штамма-размножения и 0,1 мл бактериофага, содержащего около 1×10⁹ БОЕ/мл.

Данную смесь наслаивают на агаровые пластинки в чашках и инкубируют в течение 36 ч при 37°С. По прошествии указанного времени в слое полужидкого агара наблюдали полный лизис культуры штамма-размножения. Этот слой соскабливают и помещают в колбу, куда на каждый агаровый слой добавляют по 5 мл бульона Альбими. Колбу выдерживают при +4°С в течение 24 ч, после чего содержимое центрифугируют и фильтруют (M.J.Corbel, E.L.Thomas. The Brucella phage: their properties, characterization and application, Weybridge, 1980. - P.25).

Способ является достаточно длительным, трудоемким и включает большое количество технологических операций, существенно повышающих риск контаминации фаголизата посторонней микрофлорой.

Наиболее близкой к заявляемому способу является методика размножения бруцеллезного бактериофага, по которой для репродукции бактериофага взвесь штамма-размножения до концентрации 10⁹ КОЕ/мл готовят в бульоне Мартена, содержащим дополнительно внесенный сернокислый кальций и магний, инкубируют взвесь в течение 4-6 ч при 37°С, добавляют в нее гомологичный бактериофаг в количестве, обеспечивающем множественность инфекции, равную 0,01-0,001 (т.е. около 10⁶-10⁷ БОЕ), смесь прогревают в течение 20-30 мин при 37°С и разбавляют бульоном Мартена. Полученную смесь инкубируют в течение 24-36 ч при 37°С (“Способ получения бруцеллезного бактериофага”, патент РФ №2126833).

Способ достаточно эффективен для размножения бруцеллезных бактериофагов, обеспечивает выход конечного продукта высокой конечной концентрации, однако он не применим для получения бруцеллезного диагностического бактериофага Bk2, ввиду необходимости создания определенных условий для культивирования как самого штамма-размножения, так и для репродукции бактериофага.

Целью изобретения является увеличение продукции бактериофага и обеспечение оптимальных условий размножения бруцеллезного бактериофага Bk2 в жидкой питательной среде.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве среды размножения использована разработанная нами жидкая синтетическая питательная среда для выращивания бруцелл (“Синтетическая питательная среда для выращивания бруцелл”, патент РФ №2148638), при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: агар-агар - 14,0-16,0; глюкоза - 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный - 7,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0; натрий лимоннокислый - 0,5; магний сернокислый - 0,1; аммоний сернокислый - 1,0; L-глутаминовая кислота - 0,5-1,5; L-цистеин - 0,025-0,05; L-лизин - 0,025-0,05; L-гистидин - 0,025-0,05; L-аланин - 0,025-0,05; L-метионин - 0,025-0,05; тиамин - 0,0002; никотиновая кислота - 0,0002; пантотенат кальция - 0,0002; рибофлавин - 0,0002; пиридоксин - 0,0002; биотин - 0,0002, из которой исключен агар-агар, используемый для создания плотной основы, и дополнительно внесен сульфат кальция в концентрации 10^-2-10^-3 М.

Взвесь штамма размножения готовят в синтетической питательной среде до конечной концентрации 10⁹ м.к. (микробных клеток)/мл, инкубируют взвесь в течение 4-6 ч при 37°С, добавляют в нее гомологичный бактериофаг в количестве, обеспечивающем множественность инфекции, равной 0,01-0,001 (т.е. приблизительно 10⁷-10⁶ бляшкообразующий единиц (БОЕ)/мл, затем смесь подогревают 20-30 мин при 37°С, разбавляют используемой синтетической питательной средой и инкубируют 24-36 ч при 37°С.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Использование синтетической питательной среды заданного состава, содержащей определенное количество аминокислот, обеспечивает культивирование как штамма размножения вида B.melitensis, так и успешную репродукцию бруцеллезного бактериофага Bk2. Дополнительное внесение в данную среду сульфата кальция способствует оптимальной адсорбции фаговых корпускул на поверхности бактериальной клетки штамма размножения и последующей эффективной репродукции бактериофага.

Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемая совокупность технологических приемов обеспечивает наиболее благоприятные и эффективные условия для размножения бруцеллезного бактериофага Bk2, высоко продукцивную репродукцию которого в обычных условиях на жидкой питательной среде осуществлять не удается.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Готовят взвесь штамма размножения концентрацией ~10⁹ м.к./мл в синтетической питательной среде, в которую дополнительно внесен сульфат кальция в концентрации 10^-2-10^-3 М, инкубируют взвесь в течение 4-6 ч при 37°С, добавляют в нее гомологичный бактериофаг в количестве, обеспечивающем множественность инфекции, равной 0,01-0,001 (т.е. приблизительно 10⁷-10⁶ БОЕ/мл), затем смесь подогревают 20-30 мин при 37°С, разбавляют 100 мл используемой синтетической питательной среды и инкубируют 48-72 ч при 37°С. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Определяют концентрацию бактериофага.

Возможность практического применения заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. В качестве системы фаг-культура была использована: B.melitensis Rev I + бруцеллезный бактериофаг Bk2.

Готовят взвесь культуры B.melitensis Rev I концентрацией ~1×10⁹ м.к./мл в 5 мл синтетической питательной среды, дополнительно содержащей сернокислый кальций и в концентрации 10^-2 М. Взвесь выращивают при 37°С в течение 5-6 ч, затем смешивают 0,1 мл взвеси и 0,1 мл бруцеллезного бактериофага с концентрацией 10⁹ БОЕ/мл (множественность инфекции 0,01). Смесь выдерживают при 37°С 20 мин, после чего переносят в 100 мл синтетической питательной среды и выращивают в течение 48-72 ч при 37°С. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Концентрация полученного бактериофага составляет 5×10⁹ БОЕ/мл.

Пример 2. В качестве системы фаг-культура была использована: B.melitensis Rev I + бруцеллезный бактериофаг Bk2.

Готовят взвесь культуры B.melitensis Rev I концентрацией ~1×10⁹ м.к./мл в 5 мл синтетической питательной среды, дополнительно содержащей сернокислый кальций и в концентрации 5×10^-3 М. Взвесь выращивают при 37°С в течение 5-6 ч, затем смешивают 0,1 мл взвеси и 0,1 мл бруцеллезного бактериофага с концентрацией 10⁷ БОЕ/мл (множественность инфекции 0,01). Смесь выдерживают при 37°С 20 мин, после чего переносят в 100 мл синтетической питательной среды и выращивают в течение 48-72 ч при 37°С. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Концентрация полученного бактериофага составляет 7×10⁹ БОЕ/мл.

Пример 3. В качестве системы фаг-культура была использована: B.melitensis Rev I + бруцеллезный бактериофаг Bk2.

Готовят взвесь культуры B.melitensis Rev I концентрацией ~1×10⁹ м.к./мл в 5 мл синтетической питательной среды, дополнительно содержащей сернокислый кальций и в концентрации 10^-3 M. Взвесь выращивают при 37°С в течение 5-6 ч, затем смешивают 0,1 мл взвеси и 0,1 мл бруцеллезного бактериофага с концентрацией 10⁷ БОЕ/мл (множественность инфекции 0,01). Смесь выдерживают при 37°С 20 мин, после чего переносят в 100 мл синтетической питательной среды и выращивают в течение 48-72 ч при 37°С. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Концентрация полученного бактериофага составляет 2×10⁹ БОЕ/мл.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит производить бруцеллезный бактериофаг Bk2, т.к. предлагаемый способ дает возможность осуществлять размножение бактериофага в условиях жидкой питательной среды, что сокращает длительность технологического процесса получения бактериофага и минимизирует вероятность контаминации фаголизата посторонней микрофлорой.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в технологии репродукции бруцеллезных бактериофагов. Сущность изобретения состоит в обеспечении репродукции бруцеллезного бактериофага Bk2 в жидкой синтетической питательной среде. Питательную среду используют как для приготовления взвеси штамма-размножения, так и для последующей репродукции бактериофага. Питательная среда содержит глюкозу в качестве источника углерода, набор аминокислот и минеральных солей, с дополнительным внесением в среду сульфата кальция в концентрации 10^-2-10^-3 М. Способ позволяет повысить конечную концентрацию бруцеллезного бактериофага Bk2 при репродукции фага в течение 48-72 ч.

Способ репродукции бруцеллезного бактериофага Вк2, включающий приготовление взвеси штамма размножения в жидкой питательной среде, инкубирование взвеси в течение 4-6 ч при 37°С, добавление гомологичного бактериофага и инкубирование полученной смеси для размножения бактериофага, отличающийся тем, что приготовление бруцелл осуществляют в питательной среде, имеющей следующий состав, г:

Глюкоза 1,0

Калий фосфорнокислый двузамещенный 7,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,0

Натрий лимоннокислый 0,5

Магний сернокислый 0,1

Аммоний сернокислый 1,0

L-Глутаминовая кислота 0,5-1,5

L-Цистеин 0,025-0,05

L-Лизин 0,025-0,05

L-Гистидин 0,025-0,05

L-Аланин 0,025-0,05

L-Метионин 0,025-0,05

Тиамин 0,0002

Никотиновая кислота 0,0002

Пантотенат кальция 0,0002

Рибофлавин 0,0002

Пиридоксин 0,0002

Биотин 0,0002

Кальция сульфат 10^-2-10^-3 М

Вода дистиллированная 1 л

а инкубирование смеси для размножения бактериофага осуществляют в той же синтетической питательной среде в течение 48-72 ч.