ВАКЦИНА "БИОНОР" ПРОТИВ ЧУМЫ, ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА, БОТУЛИЗМА И ПСЕВДОМОНОЗА НОРОК, ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ ЭПММ И ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ПАРВОВИРУСА ПЛОТОЯДНЫХ "ГЕРКУЛЕС" Российский патент 2000 года по МПК A61K39/295 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к средствам специфической профилактики вирусного энтерита, чумы плотоядных, ботулизма и псевдомоноза.

Известна ассоциированная вакцина для профилактики вышеперечисленных заболеваний плотоядных, включающая суспензию инактивированной культуры штамма Virus enteritis lutreo larum "Родники-1631" с титром 1:128-512 в РГА, ботулинический адсорбированный анатоксин типа C из штамма Clostridium botulinum N 59 с активностью 5-10 EC/см³, смешанную суспензию Pseudomonas aeruginosa 381-П-06 N 40, 1677-08 N 63 и "ДН"-05 N 77 с концентрацией клеток 9-11 млрд/см³ и лиофилизированный вирус Virus distemper canine штамм "ЭПМ" в титре 10^3,4-4,0 ТЦД₅₀/см³ с сорбит-желатозным стабилизатором (RU N 2086260).

Однако известная ассоциированная вакцина недостаточно термостабильна.

Целью изобретения является стабилизация иммуногенных свойств вакцины.

Технический результат - повышение термостабильности вакцины - получают за счет использования в составе вакцины новых вакцинных штаммов вируса чумы плотоядных ЭПММ и парвовируса плотоядных "Геркулес" и технологии их подготовки.

Штамм вируса чумы плотоядных ЭПММ получен пассированием исходного штамма ЭПМ через организм хорька и на фибробластах перепела, хранится в коллекции ТОО "Биоцентр" под названием "ЭПММ" и характеризуется следующими признаками:
- полиморфная частица размером от 140 до 220 нм:
- относится к семейству Paramyxoviridae, род Morbillivirus:
- лимфотропный;
- гемагглютинирующие свойства отсутствуют;
- имеет выраженное цитопатогенное действие в отношении культуры клеток ЭП;
- содержит уменьшенное на порядок по сравнению с исходным вирусом ЭПМ дефектных интерферирующих частиц (ДИЧ) (вирусных капсидов, не содержащих РНК).

Иммуногенная активность:
- при введении хорькам в титре не ниже 10^2,2 ТЦД вызывает полную невосприимчивость к заражению 1000 ЛД₅₀ вируса чумы плотоядных штамм Snyder Hill.

Титр культурального вируса 10^2,5 - 10^4,5 ТЦД₅₀/0,5 мл в культуре клеток ЭП.

Хранение в среде высушивания при pH 6.8-7,2 и температуре минус 20^oC. Допустимая длительность хранения без освежения - 2 года.

Сохраняет иммуногенность и стабильное значение титров на протяжении 10 пассажей в культуре клеток ЭП.

Иммуногенная активность сохраняется в течение 2 лет. Генетические свойства стабильные.

Штамм парвовируса плотоядных "Геркулес" выделен от больного тигра, хранится в коллекции ТОО "Биоцентр" под названием "Геркулес" и характеризуется следующими признаками:
- икосаэдр размером 20-24 нм;
- относится к семейству Parvoviridae, вид Parvovirus Carmivorum;
- эпителиотропный:
- агглютинирует эритроциты свиньи;
- активен в РГА - не ниже 1:4096 ГАЕ₅₀/0,1 мл;
- титр культурального вируса 1:64 FAE₅₀/0,1 мл в культуре CRFK;
- клеточная культура - первично-трипсинизированная почка котенка, перевиваемая линия CRFK.

Хранение - нативный, замороженный, pH среды 6,8-7,4, температура минус 56^oC.

После инактивации обладает иммуногенной активностью. Сохраняет иммуногенные свойства после 2 пассажей в культуре клеток CRFK.

Сохранение иммуногенной активности - не менее 5 лет.

Данные штаммы используют для приготовления ассоциированной вакцины "Бионор".

Приготовление вакцины иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Стадия А. - Подготовка штамма вируса чумы ЭПММ для приготовления вакцины.

Вирус ЭПММ культивируют в роллерных бутылях с площадью культивирования не менее 800 см³ на монослое фибробластов эмбриона перепела (ЭП). При получении вируссодержащей жидкости (ВСЖ) с титром не менее 10^3,0 ТЦД ее пулируют, разливают во флаконы емкостью 100 мл по 30 мл и лиофилизируют в среде высушивания, содержащей буферные соли, полимерные сахара и аминокислоты.

Контролируют специфическую активность после сушки, стерильность, безвредность, иммуногенность и термостабильность.

Для контроля термостабильности отбирают 10 ампул, прогревают при 37^oC в течение 7 дней, затем вновь проводят контроль специфической активности. Падение активности не должно привышать 0,5 lg ТЦД₅₀/0.1 мл.

Стадия Б. - Подготовка штамма парвовируса "Геркулес" для приготовления вакцины.

Вирус "Геркулес" культивируют в роллерных бутылях с площадью культивирования не менее 800 см³ на монослое клеток перевиваемой линии почки котенка CRFK. При получении ВСЖ с титром не менее 1:64 в РГА с эритроцитами свиньи ее инактивируют формальдегидом и адсорбируют на гидроокиси алюминия.

Полученный компонент вакцины жидкой консистенции.

Стадия В. - Приготовление ассоциированной вакцины "Бионор".

Для приготовления одной прививочной дозы объемом 1 мл смешивают полученный на стадии Б компонент вакцины против парвовирусного энтерита в количестве 6 log₂ ГАЕ с инактивированным формальдегидом ботулиническим анатоксином типа C из штамма Cl. botulinum N 59 с активностью 5-10 ЕС и вакциной против псевдомоноза, представляющей собой смешанную адсорбированную суспензию культур Ps. aeruginosa 381-П-06 N 40, 1677-08 N 63 и "Дн"-05 N 77 в равных соотношениях при общем количестве микробных клеток не менее 0,9 млрд.

В полученную смесь 3-х вакцинных компонентов добавляют 3 об.% 19%-го раствора метабисульфита натрия. Проводят контроль на стерильность, безвредность, остаточную концентрацию формальдегида (не выше 0,0001%), а также на способность при смешивании с сухим компонентом (вакцина против чумы) не уменьшать специфическую активность последнего в течение 1-го часа.

Сухой компонент вакцины против чумы плотоядных, полученный на стадии А, смешивают с остальными жидкими компонентами вакцины (стадия В) из расчета на 1 дозу 2,2 lg ТЦД₅₀ непосредственно перед использованием ассоциированной вакцины.

Приведенные в примере концентрации компонентов вакцины являются минимально допустимыми.

Применяют ассоциированную вакцину по известной схеме.

Проверку термостабильности сухого компонента вакцины проводили следующим образом: 150 флаконов используют для опыта и 300 флаконов - контроль. Хранение - в условиях предприятия.

Опытные флаконы прогревают при 37^oC в течение 7 дней. Каждые три месяца проводят контроль активности (ЦПД в культуре клеток) и каждый год - контроль иммуногенности на животных (хорьках) с пробойником Snyder Hill. Исходная активность вакцины - 3,5 lg. После прогревания наблюдалось падение активности на 0,5 lg. За 2,5 года наблюдения (с ноября 1995 года) активность снизилась на до 2,5 lg (допустимая активность). В контроле (без прогрева) за тот же срок наблюдения активность составила 3,0 lg.

В известной вакцине сухой компонент сохраняет активность в течение 1 года при условии ее хранения строго при плюс 2-8^oC.

Таким образом, использование новых вакцинных штаммов обеспечивает вакцине в целом высокую иммуногенность и термостабильность в процессе ее хранения.

Изобретение относится к средствам специфической профилактики заболеваний норок, в частности к вакцине "Бионор" против чумы, вирусного энтерита, ботулизма и псевдомоноза. Ассоциированная вакцина "Бинор" содержит на одну прививочную дозу (1 мл) сухую вируссодержащую жидкость штамма вируса чумы плотоядных ЭПММ со стабилизатором - титр не менее 10^2,2 ТЦД, суспензию адсорбированной инактивированной культуры штамма паровируса плотоядных "Геркулес" - титр не менее 6 log₂ РГА (до инактивации), ботулинический адсорбированный анатоксин типа С из штамма Cl. Botulinum N 59 5-10 ЕС и смешанную адсорбированную суспензию Ps.Aeruginosa штаммов 381-П-06 Т 40, 1677-08 N 63 и "Дн"-05 N 77, взятых в равных соотношениях - 0,9 млрд.кл. Использование в составе вакцины новых штаммов ЭПММ и "Геркулес", а также технология их подготовки обеспечивают высокую иммуногенность и термостабильность ассоциированной вакцины в процессе длительного хранения. 3 с.п. ф-лы.

1. Вакцина против чумы, вирусного энтерита, ботулизма и псевдомоноза норок, содержащая ботулинический адсорбированный анатоксин типа C из штамма Clostridium botulinum N 59, лиофилизированную вируссодержашую жидкость штамма вируса чумы плотоядных со стабилизатором, суспензию адсорбированной инактивированной культуры штамма вируса энтерита и смешанную адсорбированную суспензию Pseudomonas aeruginosa штаммов 381-П-06 N 40, 1677-08 N 63 и "Дн"-05 N 77, отличающаяся тем, что в качестве вируса чумы плотоядных она содержит штамм вируса чумы плотоядных ЭПММ, а в качестве вируса энтерита - штамм парвовируса плотоядных "Геркулес" при следующем количественном соотношении компонентов из расчета на 1 прививочную дозу (1 мл):
- лиофилизированная вируссодержащая жидкость штамма вируса чумы плотоядных ЭПММ со стабилизатором - титр не менее 10^2,2 ТЦД₅₀;
- суспензия адсорбированной на гидроокиси алюминия инактивированной формальдегидом культуры штамма парвовируса плотоядных "Геркулес" - титр до инактивации не менее 1 : 64 в РГА с эритроцитами свиньи;
- ботулинический адсорбированный анатоксин типа C из штамма Clostridium botulinum N 59 - активность не менее 5 - 10 ЕС;
- смешанная адсорбированная суспензия Pseudomonas aeruginosa штаммов 381-П-06 N 40, 1677-08 N 63 и "Дн"-05 N 77, взятых в равных соотношениях - не менее 0,9 млрд.м.кл. 2. Вакцинный штамм вируса чумы плотоядных ЭПММ, депонированный в коллекции ТОО "Биоцентр", используемый для приготовления вакцины для плотоядных. 3. Вакцинный штамм парвовируса плотоядных "Геркулес", депонированный в коллекции ТОО "Биоцентр", используемый для приготовления вакцины для плотоядных.