СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно определению чувствительности возбудителя инфекции к антибиотикам, и может быть использовано при экспрессном получении антибиотикограммы сибиреязвенного микроба для выбора лечебных средств и осуществления своевременной рациональной химиотерапии.

Оценка антибиотикочувствительности микробов основана на регистрации прямого действия препаратов на рост и размножение популяции возбудителя.

Сибиреязвенный микроб является спорообразующим, его споры обладают высокой устойчивостью к химическим и физическим воздействиям, что затрудняет процессы исследования этого возбудителя инфекции.

Известно, что антибиотики оказывают ингибирующее действие только на вегетативную, а не споровую форму микроба [1]. Это требует при посеве исследуемого материала на питательные среды создания условий для прорастания спор в вегетативные клетки (состав питательной среды, время инкубирования).

При исследовании возможностей активации прорастания бактериальных спор в вегетативные клетки установлено, что источником для синтеза энергии и предшественником нуклеиновых кислот являются аминокислоты, в частности, для прорастающих спор сибиреязвенной бациллы - L-aланин, L-тирозин, инозин и гипоксантин [2].

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению является иммунофлюоресцентный метод определения чувствительности сибиреязвенного микроба к химиотерапевтическим препаратам (3).

Способ осуществляется следующим образом. В агар Хоттингера pH 7,2-7,4 добавляют антибиотик соответствующей концентрации, на поверхность агара наносят исследуемую культуру и инкубируют 6-8 ч при температуре 37^oC. Затем на мазках-отпечатках культуры, обработанных спорово-соматической люминесцирующей сывороткой, регистрируют специфически флюоресцирующие клетки.

Недостатком способа является его длительность, обусловленная необходимостью продолжительной инкубации культуры для прорастания спор в вегетативную клетку.

Целью изобретения является сокращение сроков определения антибиотикочувствительности сибиреязвенного микроба для принятия о выборе рационального лечения.

Поставленная цель достигается тем, что способ определения антибиотикочувствительности сибиреязвенного микроба иммунофлуоресцентным методом включает инкубирование исследуемого материала в агаре Хоттингера, смешанном с антибиотиком и содержащем инозин или гипоксантин в количестве 10,2-25,7 мкг/мл, в течение 3-4 ч с последующим учетом флюоресцирующих клеток.

Отличительными признаками заявляемого способа является добавление в агар Хоттингера инозина или гипоксантина и проведение инкубирования в 3-4 ч.

Добавление аминокислоты в агар в заявляемых пределах способствует прорастанию спор сибиреязвенного микроба в вегетативную клетку и обеспечивает сокращение сроков инкубирования исследуемой культуры на 3-4 ч.

При снижении количества добавляемой в агар аминокислоты и уменьшении сроков инкубирования ниже заявляемых пределов не достигается в достаточной степени прорастание спор в вегетативные клетки.

Увеличение же количества аминокислоты и срока инкубирования заявляемых пределов нецелесообразно, так как заявленные пределы необходимы и достаточны для регистрации чувствительности к антибиотикам по замедлению роста клеток.

Возможность практического использования изобретения иллюстрируется примерами конкретного выполнения способа с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1.

Перед работой специальные пластмассовые планшеты стерилизовали ультрафиолетом. В расплавленный и охлажденный до 45-50^oC агар Хоттингера добавляли один объем антибиотика в соответствующей концентрации и инозина в количестве 10,2 мкг/мл. Для одного анализа использовали 3 лунки: 1 - контрольная, ее заполняли питательной средой без антибиотика, 2 и 3 - опытные, их заполняли средой, содержащей пограничные концентрации антибиотика (для чувствительных и антибиотикорезистентных микробных клеток). Лунки заполняли так, чтобы верхний мениск среды несколько выступал над поверхностью планшеты. Одну каплю исследуемой взвеси сибиреязвенного микроба наносили в концентрации 10 мк/мл. После посева планшеты оставляли для подсыхания на 10-15 мин при комнатной температуре, а затем во влажной камере помещали в термостат. Инкубировали посевы 4 ч при температуре 37^oC. По истечении указанного срока инкубации с поверхности лунок готовили мазки-отпечатки, фиксировали их в специальном растворе (96^o этанол с 6%-ной перекисью водорода), окрашивали спорово-соматической люминесцирующей сывороткой и под люминесцентным микроскопом подсчитывали количество специфически флуоресцирующих клеток. Возбудитель относили к группе антибиотикочувствительных в том случае, если положительный результат ингибиции микробного роста регистрировали в препаратах-отпечатках, приготовленных со сред, содержащих обе пороговые концентрации антибиотика. В случае, когда подавление роста отмечали только на среде с высокой концентрацией антимикробного средства, возбудитель считали умеренно устойчивым. Отсутствие разницы в развитии микроорганизмов в контрольном и обеих опытных отпечатках свидетельствовало об их устойчивости к данному средству.

Пример 2.

Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в агар добавляли 18,5 мкг/мл гипоксантина и инкубирование вели в течение 3,5 ч.

Пример 3.

Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в агар добавляли 25,7 мкг/мл инозина и инкубирование вели в течение 3 ч.

В табл. 1 представлены сравнительные результаты регистрации замедления роста клеток исследуемой культуры под влиянием антибиотика по заявляемому и способу-прототипу.

Анализ результатов регистрации роста популяции сибиреязвенного микроба свидетельствует о преимуществах предлагаемого способа перед прототипом по сокращению времени инкубирования при сокращении достоверности результатов.

Литература
1. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия.- М.: Медицина, 1982.- С.38-50.

2. Kaynan A., Evenchuk A.Z. Et at. J. Bact., 1974. - V. 88., N 2. P 313 - 318.

3. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам. -Л., 1988 г.

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано для определения чувствительности возбудителя инфекции к антибиотикам. Способ обеспечивает сокращение сроков определения антибиотикочувствительности иммунофлуоресцентным методом сибиреязвенного микроба для принятия решения о выборе рационального режима лечения. Проводят инкубирование исследуемой культуры в агаре Хоттингера, смешанном с антибиотиком, содержащей инозин или гипоксантин в количестве 10,2-25,7 мкг/мл, в течение 3-4 ч. 1 табл.

Способ определения антибиотикочувствительности сибиреязвенного микроба иммунофлуоресцентным методом, включающий инкубирование исследуемой культуры в агаре Хоттингера, смешанном с антибиотиком, с последующим учетом флуоресцирующих клеток, отличающийся тем, что в агар дополнительно вносят инозин или гипоксантин в количестве 10,2-25,7 мкг/мл, а инкубирование проводят в течение 3-4 ч.