СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ИЗ ЛИСТЬЕВ ЖЕНЬШЕНЯ Российский патент 2000 года по МПК A61K35/78 A61K31/715 A61P1/16 

Изобретение относится к медицинской и фармацевтической промышленности и касается способа получения водорастворимых полисахаридов (ВРПС) из листьев женьшеня.

Известен способ получения водорастворимых полисахаридов по методике Кочеткова Н.К. (Яковлева С.Г., Муравьева Д.А., Васильева О.Н., Муравьева Т. И. Химическое изучение надземной части фитолакки американской и культивируемого женьшеня как источников иммунотропных агентов. Материалы V российского национального конгресса "Человек и лекарство". - М., 1998. - С. 423). Измельченное сырье листьев женьшеня, просеянное через сито с диаметром отверстий 7 мм, в количестве 10 г заливали 200 мл дистиллированной воды и экстрагировали при перемешивании магнитной мешалкой в течение 1,5 ч при 20^oC; экстракцию повторяли и сырье с экстрагентом оставляли на 12 ч, фильтровали. Извлечение подвергали диализу в течение 36 ч, упаривали и водорастворимые полисахариды осаждали двухкратным объемом 96%-ного этанола. Раствор декантировали, осадок центрифугировали, высушивали в ваккум-сушильном аппарате. Осадок ВРПС взвешивали. Выход водорастворимых полисахаридов 8,17% к весу сухого сырья.

Недостатком указанного способа является его продолжительность и трудоемкость, а также небольшой выход целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является следующий способ получения ВРПС из листьев женьшеня (Qi-pm Gao, Hiroaki Klyohara, Jong-chol Cyong. and Haruki Yamada. Chemical Properties and Anti- Complementary Activities of Polysaccharide Fractions from Roots and Leaves of Panax ginseng// Planta Medica 55, 1989. - Р. 36-38). Листья женьшеня трижды экстрагировались 3-кратным объемом воды при t=100^oC на водяной бане. Полученный шрот листьев женьшеня трижды экстрагировался 4-кратным объемом 30%-ного этанола при t= 26^oC на водяной бане. Спиртовой и водный экстракты объединялись, концентрировались под вакуумом до приемлемого объема и осаждались 4-кратным объемом 95%-ного этанола. Выход водорастворимых полисахаридов из листьев женьшеня 6,25% к весу сухого сырья. Недостатками этого способа являются невысокий выход целевого продукта и длительность способа.

Задача изобретения: повышение выхода ВРПС, обладающих гепатопротекторной активностью, упрощение способа их получения, сокращение его длительности, повышение эффективности переработки женьшеня путем использования листьев женьшеня.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения ВРПС, включающем трехкратную экстракцию листьев женьшеня, объединение экстрактов, их концентрацию под вакуумом, осаждение водорастворимых полисахаридов 3-кратным объемом 96%-ного этанола с последующей фильтрацией и сушкой, экстракцию осуществляют в электроимпульсной экстракционной камере водой при гидромодуле 1: 20 и воздействии ударных волн от импульсных электрических разрядов при пробивном напряжении 27 кВ длительностью 1,2 мкс с фронтом 5 нс, в камере устанавливается межэлектродный промежуток 2 мм, обработка сырья проводится трехкратно, по 1400 импульсов в серии, каждая в течение 8 минут.

Экстрагирование проводится импульсами напряжения прямоугольной формы с наносекундным фронтом в экстракционной камере объемом 500 мл, изготовленной из полиэтилена низкого давления, с регулируемым межэлектродным промежутком.

На фиг. 1. изображена экстракционная камера 3 с электродами 1, 2, в которую помещали навеску сырья 4 и заливали водой в определенном соотношении с сухим сырьем. На электроды 1, 2 экстракционной камеры подавалась серия импульсов напряжением от 20 до 36 кВ с энергией в импульсе от 20 до 64 Дж соответственно.

Энергия импульса напряжения рассчитывается по формуле и выбирается из соотношения 20 Дж≤W≤64 Дж,
W=CU_n ²/2,
где U_n - пробивное напряжение;
С - емкость генератора в ударе.

Обоснование выбора параметров приведено в табл. 1-3.

Увеличение времени обработки сырья приводит к помутнению раствора из-за переизмельчения сырья, затруднению фильтрации, а также ухудшает качество экстракта. Наибольший выход экстрактивных веществ наблюдается при величине пробивного напряжения 27 кВ и обработке сырья в течение 24 минут (3 серии по 1400 импульсов). На табл. 1, фиг. 2 приведены данные по выходу ВРПС при обработке без смены экстрагента (серия А) и при трехкратной обработке со сменой экстрагента (серия В - вторая серия после смены экстрагента, серия С - третья серия после смены экстрагента). Выход ВРПС замерялся отдельно по каждой серии. По данным табл. 1, фиг. 2 видно, что более эффективной является трехкратная переработка листьев женьшеня. Общий выход целевого продукта повышается при этом почти в два раза по отношению к обычной серии из 4200 импульсов подряд, когда кривая процентного содержания ВРПС в экстракте выходит на насыщение при 1400 импульсов.

Существует также оптимальное значение межэлектродного промежутка (МЭП), характерное для данного вида перерабатываемого сырья (см. табл. 2, фиг. 3). Масса выделяемых ВРПС в большой степени зависит от величины МЭП и в исследованном диапазоне значений растет пропорционально его величине за счет увеличения объема смеси, подвергающейся воздействию ударных волн. Ограничение МЭП в основном обусловлено возможностями высоковольтного генератора импульсов. Как только его величина достигнет значения, когда невозможно установление устойчивого режима разряда, процесс перестает быть эффективным. С ростом МЭП увеличивается протяженность канала разряда в среде и объем обрабатываемого сырья, подвергающегося воздействию импульсных нагрузок. Такой процесс характеризуется более высокой энергией, т.к. протекает при возросшем значении пробивного напряжения.

Наиболее продуктивно, с максимальным выходом целевого продукта процесс экстракции происходит при пробое МЭП с напряженностью электрического поля Е≈135 кВ/см. При увеличении пробивного напряжения выше оптимального время запаздывания развития разряда сокращается, что равносильно сокращению длительности действующего импульса напряжения, а соответственно и импульсу тока. Это ведет к изменению параметров канала разряда и изменению характеристик воздействующих на сырье факторов (см. табл. 3, фиг. 4). В табл. 3 и на фиг. 4 приведены данные по однократной обработке 1400 импульсами (серия А) и данные по трехкратной обработке по 1400 импульсов в серии (серия В).

При обработке сырья с применением импульсных электрических разрядов происходит измельчение сырья до частиц размером 1 мм, что способствует разрыву клеток, увеличению поверхности сырья, контактирующего с экстрагентом и способствует интенсификации процесса извлечения биологически активных веществ из растительных пор-капилляров. Мощный импульсный электрический разряд в жидкости инициирует вокруг канала разряда ряд явлений, обуславливающих электрогидравлический эффект. При этом в процессах экстрагирования и гомогенизации наиболее полно используются энергия расходящейся жидкости и энергия ударной волны. Происходящая при этом деструкция растительных клеток благоприятствует экстракции, дополнительному переходу веществ, содержащихся в стенках клеток, в экстракт и извлечению ВРПС, содержащихся во внутриклеточном соке. Этим можно объяснить повышение выхода целевого продукта. Таким образом, если в известном способе определенная часть ВРПС остается неизвлеченной, то по предлагаемому способу выделение целевого продукта происходит почти полностью за счет жесткого режима экстракции.

При использовании импульсного электрического разряда происходит нагревание экстракционной смеси примерно до температуры 30-40^oC, что является оптимальной температурой для экстракции ВРПС.

Наибольший выход полисахаридов наблюдается при гидромодуле 1:20, так как при таком соотношении наблюдается максимальное извлечение ВРПС из листьев женьшеня.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения водорастворимых полисахаридов, обладающих гепатопротекторной активностью, заключается в следующем: проводится трехкратная экстракция со сменой экстрагента по 8 минут, после чего водяные вытяжки объединяют, концентрируют под вакуумом, осаждают 3-кратным объемом 96%-ного этанола, осадок фильтруют и подвергают сушке в вакуум-сушильном шкафу. Экстракцию осуществляют в электроимпульсной экстракционной камере при t= 20^oC, гидромодуле 1:20 и воздействии ударных волн от импульсных электрических разрядов длительностью 1,2 мкс, с фронтом 5 нс, при величине пробивного напряжения 27 кВ, межэлектродном промежутке 2,00 мм, количестве импульсов 1400 в серии с частотой следования 3 имп/с, трехкратно по 8 минут, а осаждение полисахаридов ведут 96%-ным этанолом.

Выход ВРПС составил 16,8% по отношению к абсолютно сухой массе сырья.

Пример 2. 5 г листьев женьшеня загружают в экстракционную камеру, приливают 100 мл воды комнатной температуры. Сырье подвергают обработке импульсными разрядами длительностью 1,2 мкс с фронтом 5 нс, пробивное напряжение 27 кВ, количество импульсов 1400 в серии, межэлектродный промежуток 1,75 мм. После трехкратной экстракции со сменой экстрагента водные извлечения объединяют, концентрируют под вакуумом, осаждают 3-кратным объемом 96%-ного этанола, диализуют, фильтруют, осадок промывают 96%ным этанолом и подвергают сушке в вакуум-сушильном шкафу.

Выход ВРПС составил 14,3% по отношению к абсолютно сухой массе сырья.

Пример 3. 5 г листьев женьшеня, проходящих сквозь сито диаметром 3 мм, загружают в экстракционную камеру, приливают 100 мл воды. Сырье подвергают обработке импульсными разрядами длительностью 1,2 мкс с фронтом 5 нс, пробивное напряжение 27 кВ, количество импульсов 1400 в серии с частотой 3 имп/с, межэлектродный промежуток 1,75 мм. После однократной экстракции в течение 8 минут водный экстракт выпаривают, осаждают этанолом, фильтруют и подвергают сушке.

Выход ВРПС составил 7,9% по отношению к абсолютно сухой массе сырья.

Водорастворимый полисахаридный комплекс, полученный из листьев женьшеня, проверялся на возможную гепатопротекторную активность. В качестве патологической модели заболевания печени исследовалось трехразовое пероральное введение белым крысам гепатотоксического яда - тетрахлорметана (CCl₄) в дозе 0.3 мг на 100 г массы животного. При этом изучаемый препарат вводился перорально в течение 10 суток ежедневно белым крысам в дозе 75 мг/кг предварительно, затем совместно с гепатопротектором.

Исследовались следующие серии животных (самцы, вес 200-250 г).

Первая серия
Белые крысы, которым вводили водный раствор ВПРС листьев женьшеня в объеме 1 мл из расчета дозы введения 25 мг/кг массы животного. Введение производили ежедневно в течение 13 дней, последние 6 дней введение сочетали с одновременным применением через день гепатотоксина - 50%-ного раствора тетрахлорметана на вазелиновом масле из расчета 0,3 мл на 100 г массы тела животного.

Вторая серия - контроль
Подопытным белым крысам вводили 50%-ный раствор тетрахлорметана из расчета 0,3 мл тетрахлорметана на 100 г массы тела. Введение производили через день трижды.

Третья серия
Исследовались интактные белые крысы (норма), не подвергающиеся какому-либо воздействию.

Четвертая серия
Подопытным белым крысам вводили в режиме, аналогичном первой серии, раствор официнального препарата "Силибор" (Машковский М.Д. Лекарственные средства. T. 1 - М., Медицина, 1992. - С. 512) в дозе 25 мг/кг массы животного. Количество животных в каждой серии равнялось 10.

Введение препарата, а также раствора гепатотоксина осуществлялось с помощью шприца с иглой и на конце с оливой, которая вводилась per os в пищевод животному.

После последнего введения животные забивались методом декапитации. В полученной после забоя сыворотке крови определялись следующие тесты, считающиеся информативными при токсическом поражении печени:
1) определялась активность аминотрансфераз в сыворотке крови (по Райтману, Френкелю, 1957 (Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. - Минск, Беларусь, 1982. - С.90-92));
2) определялась активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу;
3) определялось содержание общего холестерина в сыворотке крови, основанной на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька (Колб В.Г., Камышников B. C. Справочник по клинической химии. - Минск, Беларусь, 1982. - С.90-92)), данные приведены в табл. 4.

Заключение: таким образом, исследованный препарат обладает выраженной гепатопротекторной активностью в условиях модели острого токсического гепатита, сравниваемой с активностью официнального препарата "Силибор". Гепатопротекторная активность его сочеталась со столь же высоким гипоферментенимическим действием (торможение роста активности аланинаминотрансферазы, наблюдаемой в условиях модели). Эти свойства дают основание считать, что водорастворимые полисахариды, полученные из листьев женьшеня, могут быть использованы для создания эффективного гепатопротекторного препарата.

Таким образом, предлагаемый способ получения водорастворимых полисахаридов из надземной части женьшеня отличается от прототипа более высоким выходом биологически активных веществ в конечном продукте за счет использования электроимпульсной обработки сырья и значительным сокращением времени переработки листьев женьшеня.

Литература
1. Яковлева С.Г., Муравьева Д.А., Васильева О.Н., Муравьева Т.И. Химическое изучение надземной части фитолакки американской и культивируемого женьшеня как источников имунотропных агентов. Материалы V российского национального конгресса "Человек и лекарство" - М., 1998. - С. 423.

2. Qi-pm Gao, Hiroaki Klyohara, Jong-chol Cyong. and Haruki Yamada. Chemical Properties and Anti-Complementary Activities of Polysaccharide Fractions from Roots and Leaves of Panax ginseng// Planta Medica 55, 1989. - Р. 36-38.

3. Денисенко О.Н., Казуб В.Т., Кудимов Ю.Н., Челомбитько В.А. Экстракция изохинолиновых алкалоидов. Журнал аналитической химии, 1994. - Т. 49. - Вып. 11. - С.1205-1206.

4. Барская А.В. Исследование экстрагирования растительного сырья и экстракции водорастворимых веществ с использованием электрических импульсных разрядов. Автореферат диссертации канд. техн. наук. - Томск, 1998. - 28 с.

5. Молчанов А.А. Интенсивная обработка лекарственного сырья. - М.: Наука, 1981. - 75 с.

6. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т. 1. - М.: Медицина, 1992. - С. 512.

7. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. - Минск, Беларусь, 1982. - С. 90 - 92.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения водорастворимых полисахаридов из листьев женьшеня. Листья женьшеня измельчают до размера частиц 7 мм. Экстрагируют водой в электроимпульсной экстракционной камере при гидромодуле 1: 20 и воздействии ударных волн от импульсных электрических разрядов длительностью 1,2 мкс, с фронтом 5 нс. Количество импульсов 1400 в серии, их амплитуда 20 - 36 кВ, межэлектродный промежуток 1,75 - 2,25 мм. Экстрагируют трижды водой при 20^oC по 8 мин. Экстракты объединяют, концентрируют под вакуумом, обрабатывают трехкратным объемом 96%-ного этанола в соотношении экстрагент:этанол 1:3. Осаждают водорастворимые полисахариды. Осадок фильтруют, промывают этанолом и сушат на стекле. Изобретение позволяет повысить выход продукта, сократить время проведения процесса, упростить способ и повысить его эффективность. 4 ил., 4 табл.

Способ получения водорастворимых полисахаридов, обладающих гепатопротекторной активностью, из листьев женьшеня, включающий трехкратную экстракцию растительного сырья водой, объединение экстрактов, их концентрацию под вакуумом, осаждение полисахаридов трехкратным объемом 96%-ного этанола с последующей фильтрацией и сушкой целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют в электроимпульсной экстракционной камере при 20^oC, гидромодуле 1 : 20 и воздействии ударных волн от импульсных электрических разрядов длительностью 1,2 мкс, с фронтом 5 нс, при величине пробивного напряжения 27 кВ, межэлектродном промежутке 2,00 мм, количестве импульсов 1400 в серии с частотой следования 3 имп/с, трехкратно по 8 мин, а осаждение полисахаридов ведут 96%-ным этанолом.