АНТИТЕЛА ПРОТИВ АЛЛОГЕННЫХ И КСЕНОГЕННЫХ БЕЛКОВ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ И СПОСОБЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 A61K39/395 

Изобретение относится к диагностическим способам обнаружения природных антител, распознающих белки, экстрагируемые из органов млекопитающих, имеющие молекулярную массу приблизительно 14 кДа, обладающих противоопухолевой активностью при введении ксеногенным видам.

Изобретение также относится к природным антителам в очищенном виде и их применения в диагностике и терапии.

В WO/10197 описаны белковые вещества, получаемые экстракцией органов млекопитающих, в частности печени, перхлорной кислотой и гипертоническими солевыми растворами.

Одно из указанных веществ, имеющее молекулярную массу приблизительно 14 кДа, было выделено и частично секвенировано (патентная заявка Италии N MI 94001469) и оказалось основным белком, ответственным за наблюдаемые биологические свойства, а именно за противоопухолевую активность и способность индуцировать образование антител (антителогенез), способных узнавать опухолевые антигены, при введении животным, принадлежащим к видам, отличающимся от того вида, из которого это вещество было экстрагировано.

Вышеупомянутая патентная заявка Италии описывает также два моноклональных антитела, секретируемых гибридомами, депонированными в Европейской коллекции культур клеток животных (ECACC), Porton Down, Salisburi, UK под номерами 93080603 и 93080604, распознающих эпитопы, общие для опухолевых антигенов и для указанного белка 14 кДа из печени козы (далее называемого UK 114), используемого в качестве антигена в гибридомном препарате.

В настоящее время было обнаружено, что природные антитела, распознающие как аллогенные, так и ксеногенные белки, экстрагируемые из органов (в частности, печени), обладающие описанными выше свойствами и присутствующие приблизительно в 93% твердых опухолей человека, циркулируют в сыворотке млекопитающих. Эти антитела, в норме присутствующие с низким титром <1/100) в сыворотке здоровых животных или человека, могут быть стимулированы инъекцией соответствующего антигена, что вызывает заметное увеличение их титра и способности сывороток производить цитотоксическое действие против раковых клеток.

Независимо от возможных интерпретаций наблюдаемых результатов и значения присутствия природных антител против UK 114, интерпретации, не относящиеся к обоснованности данного изобретения, упомянутых антител и их обнаружения, являются полезными для диагностических, прогностических и терапевтических целей.

В первом варианте данное изобретение касается, следовательно, способа иммунологического обнаружения природных антител против UK 114. Изобретение касается также очищенных антител против UK 114 и их применения в диагностике, терапии и иммуноцитохимии. Способы обнаружения этих природных антител являются способами общепринятого типа и могут быть основаны на прямых, конкурентных реакциях или реакциях типа "сэндвича". В этих протоколах можно использовать либо твердые носители, либо способы иммунопреципитации. Антитела и/или антигены типа UK 114, используемые в этих иммуноанализах, должны быть подходящим образом помечены ферментами (например, в способах твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)) или радиоактивными или флуоресцентными соединениями, красителями или пигментами и т.д. Сигнал иммунного комплекса может быть необязательно усилен при помощи биотин-авидиновой системы.

Выбор формы этого способа и относящихся к нему материалов также находится в пределах квалификации среднего специалиста.

Также было обнаружено, что антитела против UK 114, присутствующие в сыворотке больных, подвергнутых лечению белками, описанными в WО 92/10197, или очищенным UK 114, обладают цитотоксической и цитолитической активностью in vitro и in vivo против опухолевых клеток человека. Данное изобретение, в следующем варианте, обеспечивает также цитолитическую и цитотоксическую композицию, содержащую моноклональные или поликлональные антитела или гипериммунные сыворотки, индуцированные иммунизацией животных или людей белками, экстрагируемыми из печени козы перхлорной кислотой и узнаваемыми моноклональными антителами, секретируемыми гибридомами, депонированными в ECACC под номерами доступа 930806103 и 930806104.

In vivo цитотоксическая активность достигает максимума спустя несколько дней после введения антигена (UK 114 или UK 101) и медленно уменьшается в течение последующих недель. Титр антител типа IgG против UK 114, в противоположность этому, медленно увеличивается во времени, как определено твердофазным иммуноферментным способом (ELISA). Следовательно, можно было бы предположить, что первый пик цитотоксичности обусловлен антителами типа IgM и/или другими компонентами сыворотки, пока еще не идентифицированными.

Во всяком случае очевидна важность способов, позволяющих определять антитела и/или цитотоксичность таким образом, чтобы можно было легко регулировать терапию.

Введение антител, либо природных, либо моноклональных, в соответствии с данным изобретением можно проводить парентерально при дозах, достаточных для достижения цитотоксического эффекта. Пригодные способы введения в основном идентичны способам, уже известным для введения вакцин, антител или гипериммунных сывороток. Настоящее изобретение и следующие далее примеры 2-4 обеспечивают дальнейшее руководство (ведущие принципы) для терапевтических и диагностических применений вышеописанных антител.

Следующие примеры иллюстрируют далее настоящее изобретение.

Пример 1
2,5% ДСН и 5% меркаптоэтанол добавляли к 100 мкл экстракта перхлорной кислотой печени козы (WO/92/10197; UK 101). Пробы нагревали до 100^oC в течение 5 минут и 4 мкл анализировали в ПААГ-ДСН в приборе для электрофореза PHAST SYSTEM (Pharmacia) с градиентным 8/25 полиакриламидным гелем (Pharmacia). Альтернативно, можно использовать гомогенные гели даже высокой плотности. Разделенные белки электрофоретически переносили с применением прибора PHAST-System (Pharmacia). Нитроцеллюлозную мембрану (0,22 мк) предварительно уравновешивали в буфере Трис (25 мМ)-глицин (192 мМ), к которому добавляли 20% метанол. Электрофорез проводили при 5 В в течение 20 минут (сила тока I А/см²). Затем эту мембрану инкубировали, после проведения насыщения, для предотвращения неспецифического связывания, с испытуемой сывороткой.

Связывание необязательно присутствующих антител обнаруживают со вторыми античеловеческими антителами A₂b, подходящим образом меченными для колориметического, радиоиммунометрического или хемилюминесцентного способов.

Пример 2
Твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) для детектирования антител к UK 114.

Использовали следующие буферы:
(A) 50 мМ бикарбонат натрия pH 8,5,
(B) 50 мМ фосфат натрия pH 7,2,
(C) 50 мМ фосфат натрия pH 7,4, 0,1% (в/об.) NaN₃,
(D) 40 мМ фосфат калия pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,02% (в/об.) NaN₃, 0,05 (об./об.) Твин 20,
(E) 50 мМ фосфат натрия pH 7,4, 0,1% (в/об.) NaN₃, 0,1% (в/об.) БСА,
(F) 50 мМ фосфат натрия pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,1%,в/об.) NaN₃, 0,5% (в/об.), 0,5% (в/об.) БСА, не содержащий протеаз, 0,05% (об./об.)
Твин 20, 0,05 (об./об.) сыворотки здоровой козы.

3,5 мл UK 114(3,5 мг) в буфере A смешивают с 9 мкл биотина NHS-LC (S.p. A. , Milan) при концентрации 2 мг/мл в диметилсульфоксиде. Эту смесь инкубировали при 22^oC в течение 3 часов и диализовали в течение 24 часов при 4^oC против нескольких смен буфера В в диализной трубке Spectrapor 6 (отсекающей 3500 Д).

Микротитрационные лунки покрывали 100 мкл комплекса БСА-биотин (5 мкг/мл в буфере C) в течение 24 часов при 4^oC, затем промывали и обрабатывали 100 мкл стрептавидина (5 мкг/мл в буфере E). После второй инкубации в течение ночи при 4^oC лунки промывали и обрабатывали 100 мкл комплекса UK 114-биотин при различных концентрациях (2,1 и 0,5 мкг/мл в буфере E) в течение 24 часов при 4^oC. После промывания лунки блокировали.

Непокрытые лунки с антигеном готовили таким же способом, за исключением третьей стадии инкубации с использованием буфера E вместо раствора UK 114-биотина.

Стадию промывания выполняли путем добавления 300 мкг/лунку буфера D три раза. Блокирование выполняли путем добавления 300 мкл буфера C, содержащего 10% сахарозы и различные блокирующие агенты: 1% и 5% БСА, 1% глицина, 1% БСА с добавлением 3% поливинилпирролидона, 5% нормальной козьей сыворотки. После 30 минут при комнатной температуре блокирующий раствор сливали, лунки сушили в вакуумной камере и затем хранили планшет завернутым в полиэтилен и алюминиевую фольгу при 4^oC до использования.

Процедура твердофазного иммуноферментного способа (ELISA)
Пробы сыворотки и отрицательный контроль разводили 1:21 буфером F перед анализом. 100 мкл проб и стандартные растворы (1, 2, 4 и 8 Е/мл в буфере F) добавляли к покрытым лункам и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре на горизонтальном шейкере (400-500 об/мин). Затем эти лунки промывали четыре раза 300 мкл буфера D, после чего добавляли 100 мкл раствора 1: 3000 меченных пероксидазой хрена козьих антител против IgG человека, растворенных в буфере Stabiligen. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре на горизонтальном шейкере (400-500 об/мин) планшеты промывали и проявляли с применением 100 мкл раствора Blue Star (H₂O₂/ТМВ). После инкубации при комнатной температуре (18-24^oC) в течение 15 минут реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М H₂SO₄ и оптическую плотность (OD) регистрировали при помощи фотометра при 450 нм и 630 нм в качестве стандартной длины волны.

Образцы с OD более высокой, чем 8 Е/мл, разводили далее перед анализом.

Концентрацию образца рассчитывали из стандартной кривой.

Определение титра антител в больных, подвергающихся иммунотерапии
Оценка титра антител против UK 114, которую проводят в больных, подвергающихся терапии посредством UK 114, показывает ответ в виде образования антител, более высокий, чем фоновая величина, в 28% пациентов с раком молочной железы и 46% пациентов с раком ободочной кишки сразу же спустя 15 дней после введения UK 101 (4 подкожные инъекции). Спустя 40 дней от начала терапии посредством UK 101 увеличение титра антител против UK 114 можно было обнаружить в 63% и 97% пациентов с раком ободочной кишки и молочной железы, соответственно (фиг. 1 и 2).

Пример 3
Цитотоксическое действие антител против UK 114 на линиях опухолевых клеток.

Линии опухолевых клеток КАТО-III (рака желудка) и NICH (мелкоклеточного рака легких), соответственно положительные и отрицательные для поверхностного окрашивания посредством непрямой иммунофлуоресценции моноклональными антителами, секретируемыми из гибридомы P3DIDII, депонированной в ECACC под N 930806103, и кроличьи поликлональные антитела против UK 114 (rAb) использовали для исследований цитотоксичности. Цитотоксичность оценивали в процентах высвобождения ⁵¹Cr из клеточных линий, инкубированных в течение вариируемого периода времени с различной концентрацией mAb P3DIDII, Rb Ab против UK 114 или с не относящимися к ним моноклональными или поликлональными антителами в качестве контроля, в присутствии источника гетерологичного (морские свинки) или гомологичного комплемента или в присутствии очищенных моноцитов человека. Было обнаружено, что как mAb P3DIDII, так и rAb против UK 114, но не контрольные, не относящиеся к ним антитела, индуцировали в КАТО-III комплемент- зависимую цитотоксичность, которая отсутствовала при применении в качестве источника комплемента инактивированных нагреванием или C9-недостаточных сывороток. Восстановление цитотоксичности происходило при реконституировании C9-недостаточной сыворотки с очищенным C9. Кроме того, Rb Ab против UK 114, но не Rb Ab, не относящиеся к ним, индуцировали зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC) при использовании в качестве мишени КАТО-III. Предварительная адсорбция антител против UK 114 очищенным антигеном снимала индуцированную антителами цитотоксичность. В противоположность этому, для NICH не наблюдали комплемент-зависимой цитотоксичности или ADCC. Эти результаты предполагают, что антитела против UK 114 имеют потенциальную комплемент-зависимую и антитело-клетка-зависимую цитотоксичность в отношении опухолевых клеточных линий с поверхностной экспрессией антигена UK 114.

Пример 4
Цитотоксичность in vivo антител против UK 114 на голой мыши, ксенотрансплантированной опухолевыми клеточными линиями человека.

Голых мышей стимулировали подкожной инъекцией 1•10⁶ клеток HT29 аденокарциномы ободочной кишки человека. Спустя 8 часов им вводили инъекцией в месте опухоли 0,2 мл кроличьей гипериммунной (титр 1/12) сыворотки, полученной иммунизацией кроликов посредством UK 114. Инъекции повторяли на 7-ой, 11-ый, 14-ый, 18-ый, 21-ый и 25-ый дни после стимулирования. Другая группа мышей получала такую же обработку сыворотками из опухолевых больных, которые клинически давали ответную реакцию на введение UK 114 и продуцировали антитела (Ab) против UK 114.

Контрольная группа получала только носитель. Обработанные группы обнаружили статистически значимое увеличение продолжительности жизни и уменьшение числа опухолей. Латентное состояние опухоли было также заметно пролонгировано в получивших обработку группах в сравнении с контрольной группой. В качестве примера результаты, полученные с кроличьей антисывороткой и с сывороткой человека, представлены в таблице.

Изобретение относится к диагностическим способам обнаружения природных антител, узнающих белки, экстрагируемые из печени козы, имеющие молекулярную массу приблизительно 14 кДа, с противоопухолевой активностью при введении ксеногенным видам, а также к композиции, содержащей эффективное количество антител или гипериммунные сыворотки, индуцированные иммунизацией животных или людей белками с М.в. 14 кДа, экстрагируемыми из печени козы. Изобретение обеспечивает получение композиций, обладающих цитотоксическими свойствами. 3 с. и 1 з.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ иммунологического обнаружения природных антител, распознающих белок с М.в. 14 кДа, экстрагируемый из печени козы, который узнается моноклональными антителами, секретируемыми гибридомами, депонированными в ЕСАСС под номерами доступа 930806103 или 930806104, и который присутствует приблизительно в 93% твердых опухолей человека, заключающийся в обнаружении иммунного комплекса между указанными природными антителами и указанными необязательно мечеными белками. 2. Способ по п.1, в котором иммунный комплекс обнаруживают при помощи второго меченого антивидового антитела. 3. Поликлональные антитела, относящиеся к классам IgG и IgM и обладающие цитотоксической активностью против опухолевых клеток, узнающие белки, экстрагируемые из органов млекопитающих, которые узнаются моноклональными антителами, секретируемыми гибридомами, депонированными в ЕСАСС под номерами доступа 930806103 или 930806104, и которые присутствуют приблизительно в 93% твердых опухолей человека. 4. Цитотоксические композиции, содержащие эффективное количество поликлональных антител, относящихся к классам IgG и IgM и обладающих цитотоксической активностью против опухолевых клеток, или гипериммунные сыворотки, индуцированные иммунизацией животных или людей белками с М.в. 14 кДа, экстрагируемыми из печени козы перхлорной кислотой и узнаваемыми моноклональными антителами, которые секретируются гибридомами, депонированными в ЕСАСС под номерами доступа 930806103 или 930806104.