Способ определения концентрации иммуноглобулинов в биологической жидкости Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинической иммунологии для определения концентрации имунноглобулинов в биологической жидкости.

Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят гель, содержащий 0,8 - 1,8% агара, 2 - 3% полиэтиленгликоля и 7 - 10% этиленгликоля. Для этого в физиологический раствор засыпают соответствующее количество агара и оставляют на 2 -,3 ч для набухания. После этого добавляют полиэти- ленгликоль и этиленгликоль в соответствующих количествах и инкубируют при 80° С в течение 2 ч. Получают агаровый гель, который можно хранить до использования в холодильнике. Полученный агаровый гель доводят до 50° С, после чего к нему приливают моноспецифическую антисыворотку к иммуноглобулинам класса А, М или G в таком количестве, чтобы конечная концентрация в растворе соответствовала указанной на ампуле, перемешивают и используют для заготовки пластин с полосками агарового геля. Для этого на пластину из стекла или прозрачной пластмассы накладывают трафарет, позволяющий получать полоски геля шириной 2-3 мм на расстоянии 5-6 мм друг от друга, лежащие на плоскости пластины.

После застывания агара трафарет снимают (можно использовать разовые трафареты и не снимать их, остав/ яя в системе). Разные области пластины можно заполнять агаровым гелем с антисыворотками к иммуноглобулинам разных классов, окрашивая агар с разными антисыворотками красителями разного цвета - тогда на одной пластине будут полоски агара с антисыворотками

f

О

о

СА) CJ

для определения содержания иммуноглобулинов разных классов, окрашенные в разные цвета. Полученную готовую систему для определения содержания иммуноглобулинов накрывают крышкой, герметизируют при помощи клейкой полиэтиленовой ленты и хранят при-1... - 8° С до 1 года.

Перед использованием систему вскрывают, на полосы агара перпендикулярно к ним накладывают стандартные полоски хроматографической бумаги, например № 15, размером 2x5 мм, пропитанные тестируемой жидкостью, так, чтобы концы этих полосок находились вне полоски агара. Накладывают также полоски, пропитанные контрольной сывороткой в различных разведениях. Затем систему с нанесенным тестируемым материалом вновь закрывают крышкой, герметизируют клейкой полиэтиленовой лентой и инкубируют при 36° С в течение 12-40 ч. После окончания инкубации крышку снимают, пластину погружают в 10 - 15% -ный водный раствор уксусной кислоты, через 10 мин вынимают и измеряют ширину преципитата при помощи, бинокулярной лупы. По. данным контрольных сывороток в разных разведениях строят калибровочную кривую, по которой определяют содержание иммуноглобулинов в сывортке или другой текстируемой жидкости.

Пример1.0,8г агара заливали 50 мл физиологического раствора, оставляли для набухания на 2 -3 ч. После этого добавляли 2 г полизтиленгликоля и 7 г этиленгли- коля и доливали физиологический раствор до общей массы раствора 100 г, тщательно перемешивали и инкубировали при 80°С периодически перемешивая, а течение 2 ч. Полученный гель использовали для получения геля с антисывороткой к иммуноглобулинам класса А, М или G. Для этого температуру геля доводили до 50°С и добавляли соответствующую антисыворотку в количестве, определенном инструкцией используемого комплекта, тщательно перемешивали 3 - 4 мл полученной смеси заливали на предварительно нагретую до 50°С прозрачную пластину размером 8x12 см с приклееным к ней трафаретом из пластмассы толщиной 2 мм. Пластина должна лежать в строго горизонтальном положении. В результате на пластине получали 11 полос агара шириной 2 мм. длиной Т1 см. После застывания геля и охлаждения пластину накрывали крышкой, герметиз ировали при помощи пластиковой изоляционной ленты и хранили до использования при 1... - 8° С.

Перед использованием систему (пластину с полосами геля) доводили до комнатной

температуры, затем раскрывали. Полоски хроматографической бумаги размером 2x5 мм брали за конец пинцетом, пропитывали текстируемым материалом и накладывали

перпендикулярно полосам геля на расстоянии 1 - 1,5 см друг от друга, плотно прижимая к поверхности геля пинцетом. На полосы геля накладывали также полоски бумаги, пропитанные стандартной сыворот0 кой человека, неразведенной и в разведениях 1:2, 1.4, 1:8, 1:16. После нанесения всех образцов указанным способом систему вновь герметично закрывали, герметизируя клейкой пластиковой лентой, и

5 инкубировали при 37° С для JgG до 22 ч, для JgA до24ч, для JgM до40ч. Затем пластины погружали в 10% - ный водный раствор уксусной кислоты. Через 10 мин пластины вынимали и измеряли ширину проявлен0 ных преципитатов при помощи бинокулярной лупы с .окуляр-микрометром. По стандартной сыворотке в разных разведениях строили калибровочную линию, по которой определяли содержание иммуногло5 булинов в тестируемой жидкости.

Указанным способом тестировали следующие образцы.

1.У горнорабочего В., 29 лет, выделяли сыворотку крови. Сыворотку хранили в за0 мороженном состоянии, перед тестированием размораживали.

2.У горнорабочего М., 45 лет, выделяли плазму крови (центрифугированием гепари- низированной крови). Плазму хранили в за5 мороженном состоянии, перед тестированием размораживали,

3.У лаборанта А., 24 г., прокалывали палец, полоски хроматографической бумаги непосредственно перед определением про0 питывали кровью из пальца.

4.У больного С,, 37 лет (диагноз - варикозное расширение вен правой нижней конечности в стадии декомпенсации, трофическая язва голени) полоски хроматог5 рафической бумаги пропитывали отделяемым язвы.

5.У больного М., 42 лет (диагноз - стоматит автозный), полоски хроматографической бумаги прикладывали к пораженным

0 участкам слизистой оболочки полости рта.

6.У горнорабочего С,, 30 лет, брали слюну. Хранили в замороженном состоянии, перед тестированием размораживали.

Данные анализов приведены в табл. 1. 5Пример 2. Агаровый гель с антисыворотками и систему для определения иммуноглобулинов готовили так же, как в примере 1, но на 100 г-раствора брали 1 г агара, 2,5 г полиэтиленгликоля, 10 г этилен- гликоля. Для проявления использовали

15%--ный водный раствор уксусной кислоты. Тестировали т8 же жидкости, что и в примере 1. Результаты анализов приведены в табл. 1.

Примерз. Агаровый гель с.антисыво- ротками готовили так же, как в примере 1, но брали 1,8% агара, 3% полиэтиленглико- ля, 8% этиленгликоля. К прозрачной пластине размером 8 X 12 см плотно прижимали и закрепляли трафарет, равномерно смазан- ный вазелином. Пластину нагревали до 50°С, после чего заливали гелем (3 - 4 мл на пластину) при 50°С. Посде застывания геля трафарет аккуратно снимали. Получали 10 поаосок агара шириной 3 мм. длиной 11 см. Готовую систему накрывали, герметизировали при помощи изоляционной ленты и хранили при-1... -8°С до использования, Для проявления преципитатов использовали 12% - ный раствор уксусной кислоты. Тестировали те же жидкости, что и в примере 1. Результаты анализов приведены в табл.1. , ...

Данные, подтверждающие достижение указанной цели, представлены в табл. 2 и 3.

Из табл. 2 видно, что ошибка, получаемая при тестировании одной пробы трижды по предлагаемому способу, достоверно (piD,001) и существенно (в 6 и более раз) ниже, чем по прототипу, что свидетельствует о повышении точности предлагаемого способа по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: область применения предлагаемого способа существенно шире за счет снижения материалоемкости и увеличения длительности хранения системы от 2 недель до 1 года: он требует материалов в 3 - 5 раз меньше, обладает более высокой точностью

в связи с работой по принципу линейной иммунодиффуаии, менее трудоемок, так как не требует пробивания лунок, внесения в них тестируемой жидкости при помощи микрошприца, окрашивания; удобен, поскольку предполагает внесение материала для исследований непосредственно из объекта без предварительного забора И подготовки ма- териала; требует очень мало тестируемого материала, что позволяет определять иммуноглобулины в отделяемом ран, влокальнь1х областях поверхности слизистых оболочек, в крови непосредственно из пальца (не только у взрослых, но, что особенно важно, у детей младшего возраста) или из ран; значительно менее травматичен для пациента. Предлагаемый способ полностью готов к применению и может быть рекомендован к широкому использованию в клинических иммунологических лабораториях и в экспедициях при проведении массовых иммунологических обследований.

Формула изобретения Способ определения концентрации иммуноглобулинов в биологической жидкости путем пропитывания носителя исследуемой жидкостью с последующим нанесением на агаровый гель, содержащий антисыворотку, инкубации и вычисления концентрации по значению участков преципитации, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа,вводят 2 - 3%-ный полиэтиленгликоля и 7-10% этиленгликоля в агаровый гель, из которого готовят полоски шириной 2-3 мм, после чего на них накладывают полоски носителя из крупнопористой хроматографической бумаги, а после инкубации участки преципитации обрабатываются 10 - 15% - ным раствором уксусной кислоты.

Таблица1

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии. С целью упрощения и повышения точности способа применяют приготовляемый в виде полосок толщиной 2-3 мм агаровый гель (0,8-1,8%), содержащий полиэтиленгликоль (2-3%) и этиленгликоль (7-10%), на который накладывают полоски (2х5 мм) хроматографической бумаги, например N 15, пропитанные исследуемой жидкостью, с последующим измерением участков преципитации, просветляемых после инкубации 10-15%-ным раствором уксусной кислоты. Применение способа в практике позволяет повысить точность определения в 6 раз, снизить травматичность, увеличить сроки хранения системы до 1 года и снизить расход материалов в 3-5 раз.

Примеры использования способа пря тестировании различных биологических жидкостей

Таблица 2

Ошибка, получаемая при троекратном тестировании одной пробы по предлагаемому способу и прототипу { исследовано 48 проб плазмы)

ТаблицаЗ

Количество материалор, используемых для тестирования по трем классам иммуноглобулинов 960 образцов

Продолжение табл. 1