СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/569 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для ускоренного обнаружения чумной инфекции в объектах внешней среды.

Традиционная лабораторная диагностика чумы, включающая выделение чистой культуры с последующей ее идентификацией, позволяет сделать окончательное заключение о наличии в материале чумного микроба через 96-168 ч от начала анализа. Распространенные способы экспресс-диагностики, такие как метод флюоресцирующих антител, гемагглютинационные тесты, иммуноферментный анализ не отличаются высокой чувствительностью (10⁴-10⁵ м.к./мл), специфичность их в значительной степени определяется качеством диагностических иммуноглобулинов и не обнаруживают штаммы чумного микроба, не продуцирующие оболочечный антиген (Руководство по профилактике чумы. Саратов, 1992).

Известен способ лабораторной диагностики чумы, который с целью выделения чистой культуры из исследуемой пробы и ускорения диагностики предусматривает предварительное введение пробы биопробным животным (Пат. РФ N 2077591, C 12 Q 1/04, G 01 N 33/569, 20.04.97, Бюл. N 11). Исследуемую пробу вводят белым мышам подкожно в область спины в смеси с активатором (яичный желток, гепаринизированная кровь), иммунодепресанта (кортизон), ингибиторов роста посторонней микрофлоры (натрия азид, кадмий хлористый), патологический материал берут с места введения и направляют на бактериологический, серологический и иммунофлюоресцентный анализы.

Экспериментально установлено, что при такой подготовке исследуемой пробы чумной микроб в дозе 10 м.к./мл идентифицируется через 2-е суток, в дозе 1-5 м.к./мл - через 3-е суток.

Исследуемые пробы почвы, субстратов нор грызунов, блох, материалов от больных людей и животных на ранней стадии заболевания содержат единичные клетки возбудителя чумы. Поэтому известные способы обнаружения микробов чумы при выявлении источников инфекции на эпизоотийных территориях в чрезвычайных ситуациях недостаточно экспрессны.

В последнее время активно развиваются генетические методы идентификации микроорганизмов. Предложен метод амплификации in vitro единичных копий определенной последовательности ДНК. Этот метод назван полимеразной цепной реакцией (ПЦР), основной которого является использование ДНК-полимеразы для многократной генерации новых копий последовательности ДНК, фланкируемых олигонуклеотидными праймерами (О.В.Норкина. Детекция возбудителя чумы с использованием полимеразной цепной реакции. Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук. Саратов, 1993).

Экспериментально были разработаны основные параметры детекции возбудителя чумы с использованием ПЦР при работе с биологическим материалом (кровь инфицированных животных и инфицированные блохи).

Наилучшие результаты были достигнуты при использовании щелочного лизиса клеток с последующей фенольной депротеинизацией для очистки ДНК и концентрацией нуклеиновых кислот этанолом. Результаты реакции учитывали путем электрофореза реакционной смеси в 2-3% агаразном геле и визуализации фрагментов ДНК, окрашенных бромистым этидием в УФ-свете. При этом чувствительность метода составляла 100 КОЕ в организме одной блохи и 100-200 КОЕ на 1 мл образца инфицированной крови. ПЦР-амплификация в одной реакционной смеси генов, кодирующих оболочечный антиген фракцию 1 (cafI) и фибринолизин-плазмокоагулазу (pla), а также гена gop A, расположенного на плазмиде pCad, позволяет непосредственно в биологических образцах детектировать клетки чумного микроба по совокупности обнаруженных генов и получать представление о потенциальной вирулентности обнаруженного штамма. Время, необходимое для проведения этого теста, составляет 5-6 ч.

Использование ПЦР на пробах с единичным содержанием микробных клеток до 10 КОЕ неосуществимо.

Целью изобретения является ускорение процесса обнаружения типичных штаммов возбудителя чумы и не синтезирующих капсульный антиген при единичном содержании микробных клеток в пробах и повышение достоверности микробиологического контроля объектов внешней среды эпизоотийных территорий в чрезвычайных ситуациях.

Поставленная цель достигается тем, что исследуемую пробу предварительно вводят биопробным животным в область спины в присутствии активаторов, иммунодепрессанта, ингибиторов роста посторонней микрофлоры, а патологический материал с места введения через 23-25 ч направляют на ПЦР.

Существенным отличительным признаком заявляемого способа является предварительная подготовка исследуемой пробы путем локального размножения возбудителя чумы в биопробном животном с подавлением роста посторонней микрофлоры, что обеспечивает необходимое содержание микробных клеток при единичном их содержании в исходном материале, для обнаружения их в ПЦР через 28-31 ч после инъекции, а кроме того, в совокупности с ПЦР позволяет обнаруживать клетки чумного микроба, не продуцирующие капсульный антиген.

Снижение времени роста клеток в биопробе ниже 23 ч не обеспечивает чувствительность ПЦР.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами экспериментальных исследований.

Пример 1. Готовят исследуемую суспензию чумного микроба в концентрации 10 м.к./мл. 1 мл исследуемого материала смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,5-0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,002-0,005 мг натрия азида, 0,02-0,1 мг кадмия хлористого. Приготовленную смесь вводят под кожу спины 3 белым мышам. Через 24 ч после инъекции животных умерщвляют и патологический материал с места введения направляют на бактериологический, серологический и иммунофлюоресцентный анализы, а также на ПЦР. Бактериологическим, серологическим, иммунофлюоресцентным и ПЦР методами чумной микроб обнаруживался.

Пример 2. Осуществляли аналогично примеру 1 за исключением того, что концентрация исследуемого материала составляла 5 м.к./мл, а патологический материал брали через 25 ч после инъекции.

Серологическим и иммунофлюоресцентным методами чумной микроб не обнаруживался, но высевался бактериологическим методом через 72 ч от начала исследования и выявлялся в ПЦР через 28-31 ч за счет амплификации плазмидных генов cafI, pla, gop A.

Пример 3. Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что готовили исследуемую суспензию чумного микроба из безфракционного штамма.

Серологическим и иммунофлюоресцентным методами чумной микроб не обнаруживался, но высевался бактериологическим методом через 48 ч от начала исследования и выявлялся в ПЦР через 28-31 ч от начала исследования за счет амплификации плазмидных генов pla, gop A.

Пример 4. Готовили исследуемую суспензию чумного микроба в концентрации 10 м.к./мл и осуществляли ПЦР по известной методике. Амплификация не наблюдалась.

Таким образом, использование заявляемого способа обеспечит не только значительное ускорение, но и надежность обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для ускоренного обнаружения чумной инфекции в объектах внешней среды. С целью ускорения процесса обнаружения возбудителя чумной инфекции при единичном содержании микробных клеток в пробах исследуемую пробу предварительно вводят биопробным животным в область спины в присутствии активаторов, иммунодепрессанта, ингибиторов роста посторонней микрофлоры и патологический материал с места введения через 23 - 25 ч исследуют в полимеразной цепной реакции. Способ обеспечивает ускорение и надежность обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды.

Способ обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды, включающий анализ исследуемого материала методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что исследуемую пробу предварительно вводят биопробным животным в область спины в присутствии активаторов, иммунодепрессанта, ингибиторов роста посторонней микрофлоры и патологический материал с места введения исследуют через 23 - 25 ч.