СПОСОБ УСКОРЕНИЯ ОКИСЛЕНИЯ ОКСИДА АЗОТА (NO) В ГЕТЕРОГЕННОЙ СРЕДЕ Российский патент 2000 года по МПК C01B21/40 A61K31/02 A61K38/02 

Изобретение относится к области химии, биохимии и медицины, в частности к регуляции NO-зависимых процессов в живых организмах.

Оксид азота (NO) - важнейший неорганический метаболит всех высших животных [1-5] . Он участвует в регуляции диаметра кровеносных сосудов [3] и септическом шоке [6], в передаче и хранении информации [4]; является исходным продуктом для синтеза пероксинитрита, который убивает патогенные бактерии и раковые клетки [7, 8]; и выступает в качестве поглотителя свободных радикалов [9, 10]. У млекопитающих NO образуется в результате окисления аргинина кислородом под действием NO-синтаз [4, 11] и распадается при дальнейшем окислении. Известны два основных конкурирующих пути окисления NO: комплексы переходных металлов, например, Hb-O₂, быстро и необратимо окисляют NO в нитрат (1)-трехэлектронное окисление; в отсутствие переходных металлов свободный O₂ окисляет NO до нитрита или нитрозосоединений (2) - одноэлектронный процесс [1, 5, 12]
NO + Hb⁺² - O₂ ---> NO^-3 + Hb⁺³; (1)
4NO + O₂ + 2H₂O ---> 4NO₂ ^- + 4H⁺; 4NO + O₂ + 2RSH ---> 2RSNO + 2NO₂ ^- + 2H⁺ (2)
Фактически реакция (2) обратима, потому что in vivo нитрит и нитрозотиолы могут снова восстанавливаться в NO [5, 13-15]. Таким образом, отношение скоростей процессов (1) и (2) регулирует пул NO и NO-эквивалентов, а через них важнейшие функции организма в норме и патологиях [5, 10, 16].

Известными способами ускорения химических реакций, в т.ч. (2), являются увеличение концентраций реагирующих веществ (реакция (2) суммарно третьего порядка), достигаемое различными методами, и повышение температуры. Для биохимических и медицинских приложений этот путь часто неприемлем, поскольку концентрации NO и кислорода задаются физиологией. Во многих случаях (например, при септическом шоке) целью ускорения реакции (2) является необходимость локального уменьшения концентрации NO с одновременным увеличением концентраций продуктов окисления (например, нитрозотиолов, выполняющих различные физиологические функции, включая транспорт NO в виде NO-эквивалентов).

Известен также способ ускорения окисления NO в результате мицеллярного катализа [1, 2], при этом гидрофобная фаза действует как губка, концентрируя реагенты в малом объеме. В [1] способ реализован экспериментально при добавке к гомогенному водному раствору эмульсий, содержащих гидрофобные компоненты, например, липосом. При этом скорость реакции, наблюдаемая по убыли концентрации NO, возрастала, т.е. было показано, что скорость окисления в гетерогенной среде выше, чем в гомогенной. Одновременно в [1] без доказательств принималось, что зависимость достигаемого ускорения от доли добавляемой гидрофобной фазы монотонна (с увеличением доли гидрофобной фазы скорость реакции непрерывно растет).

Наиболее близким аналогом предлагаемого технического решения можно считать работу [2], в которой было теоретически показано, что эта зависимость имеет максимум при относительно малых долях гидрофобной фазы, при дальнейшем увеличении доли гидрофобной фазы скорость реакции падает, предложена формула для расчета ускорения процесса окисления NO в многокомпонентных системах. Эту работу можно принять за прототип. Однако в [2] не был предложен практически применимый способ ускорить реакцию одноэлектронного окисления NO в гетерогенной среде, например в крови. В работе также содержалась алгебраическая ошибка в формуле.

В статье [17] Н. Беда и Т. Сунцовой (авторы настоящей заявки - в соответствии с требованием статьи 4-1 Патентного закона РФ заявка подается ранее шести месяцев со дня выхода статьи (18.06.99)) ошибки в ранее опубликованных работах были проанализированы.

Из уровня техники неизвестно, как ускорить реакцию одноэлектронного окисления NO (2) в изначально гетерогенной системе (практически важный случай - в крови), не изменяя ни количеств реагирующих веществ, ни температуры и давления в системе. Предлагаемое техническое решение состоит в изменении реакционной среды так, чтобы в ней возникла новая фаза с более высоким значением коэффициента распределения Q_NO и/или так, чтобы значение выражения,

где H - ускорение реакции, k_i - константа скорости реакции в i-й фазе, Q_NO,i, - равновесный коэффициент распределения NO и O₂ в i-й фазе, x_i - доля i -й фазы в общем объеме.

описывающее общее ускорение реакции по всей системе (суммарно по всем фазам) возросло. Это может быть достигнуто введением в реакционную среду более гидрофобного компонента (например, перфторуглеводорода) с высоким значением Q_NO и/или
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень (т.е. не следует явным образом из уровня техники) - действительно, выдан патент США [19] (1998 г.), где заявлено использование эмульсий перфторуглеводородов для увеличения концентрации NO в организме пациента - авторы предполагают, что NO будет растворяться в гидрофобной фазе, а окислением пренебрегают.

Предлагаемое техническое решение практически осуществимо, например, при использовании смеси перфторуглеводородов - "перфторан" (является лекарственной формой, разрешенной к клиническому применению). Перфторуглеводороды разрешено использовать как кровезаменители, при этом в кровяное русло вводят существенно больше перфторуглеводорода, чем требуется для достижения максимального ускорения реакции в соответствии с уравнением (3).

Для иллюстрации изобретения приводятся следующие примеры. Эффект мицеллярного катализа был доказан исследованием начальной кинетики окисления оксида азота кислородом в воде, в плазме крови, в растворе эмульсии перфторуглеводородов в воде и в плазме крови после солюбилизации перфторуглеводородов. В качестве эмульсии перфторуглеводородов использовали эмульсию перфтордекалина и эмульсию перфтороктилбромида, стабилизированные поверхностно- активным веществом (Pluronic), а также лекарственную форму - эмульсию "перфторан" (содержание перфтордекалина 13 г, содержание перфторметилциклогексилпиперидин 6,5 г на 100 мл). Солюбилизация перфторуглеводородов белками плазмы проводили под действием ультразвука при смешивании плазмы крови с раствором эмульсии перфторуглеводородов. Несолюбилизированную часть эмульсии отделяли от раствора плазмы центрифугированием. Воду, после удаления кислорода, насыщали газообразным оксидом азота. С помощью герметичного стеклянного шприца воду V = 1 мл, насыщенную оксидом азота, добавляли к реакционной смеси, находящейся на воздухе. Отбор проб производился через каждые 10 секунд, объем пробы составлял 50 мкл. За кинетикой окисления оксида азота следили по продукту реакции - нитрит иону.

4NO + O₂ + 2H₂O = 4HNO₂. (4)
Определение концентрации нитрита производилось немедленно после отбора пробы стандартными реактивами фирмы "R&D Systems" по образованию азокрасителя с максимумом поглощения на длине волны 540 нм. Спектрофотометрические измерения были сделаны на спектрофотометре "Shimadzu 2401 PC". Кинетические данные обрабатывались с помощью программы Origin версии 5,0.

Отношение начальных скоростей реакции окисления NO в присутствии эмульсии перфторуглеводородов и в дистиллированной воде (см. табл.1).

Отношение начальных скоростей реакции окисления NO в присутствии эмульсии ПФУ, солюбилизированной в плазме крови и в плазме без эмульсии ПФУ W_ПФУ ⁰/W_плазма ⁰ (см. табл. 2).

На фиг. 1 представлена типичная кинетика окисления NO в воде и эмульсии ПФУ.

Пример 6. Мицеллярный катализ окисления NO in vivo.

Эксперименты были выполнены на 40 крысах - самцах нормотензивной линии Wistar весом 180-400 г. За сутки до эксперимента животным под кетаминовым наркозом (5 мг/100 г интраперитонеально) вживляли полиэтиленовые катетеры (РЕ-10). Бедренная артерия была катеризирована для дальнейшего подключения к датчику регистрации АД, а бедренная вена - для внутривенного введения лекарственных препаратов. Артериальное давление и частоту сердечных сокращений измеряли в брюшной аорте с помощью датчика давления, подключенного к входу усилителя. Сигнал от усилителя передавался на цифровой преобразователь PowerLab, соединенный с Makintosh LC-II.

Все животные были разделены на две группы, каждая из которых состояла из контрольной и опытной подгрупп. Опытной подгруппе вводили перфторан (НПО "Перфторан") из расчета 5 мл/кг, контрольной -аналогичное количество модифицированного раствора Кребса-Гензелейта (КГ). При помощи перфузатора растворы подавались в венозный катетер с постоянной скоростью (0,2 мл/мин). Мониторинг артериального давления и частоты сердечных сокращений продолжали в течение полутора часов после введения растворов.

После регистрации исходного уровня АД первой группе крыс (группа L-NAME) вводили неселективный ингибитор NO-синтаз - метиловый эфир N^ω- нитро-L-аргинина (Sigma Chemical Co.) в дозе 50 мг/кг (в 1 мл физ. раствора) внутрибрюшинно. Через полтора часа, когда АД устанавливалось на постоянном уровне, животным вводили нитрит натрия (1 мг/кг в 1 мл физ. раствора внутрибрюшинно). После стойкого снижения АД животным вводили Перфторан (или КГ).

Второй группе крыс (FC-группа) Перфторан (или КГ) вводили сразу после регистрации исходного уровня АД.

Перед началом каждого эксперимента, после того, как АД на фоне введения L-NAME и нитрита натрия устанавливалось на постоянном уровне, а также сразу после завершения мониторинга, из артериального катетера отбирали по 0,2 мл крови.

Измерение концентрации NO₂ ^- / NO₃ ^- в плазме крови.

Количество нитрита и нитрата в крови определяли фотометрически при помощи стандартного набора реактивов фирмы "R&D Systems". Для анализа было необходимо 0,1 мл плазмы по 50 мкл на каждый анион. Последовательность действий была следующей.

Определение нитрита:
1) в пробирку 1,5 мл отмеряли 50 мкл реакционного буфера;
2) добавляли 50 мкл образца (в нулевой раствор добавляли 50 мкл реакционного буфера);
3) добавляли к образцу 50 мкл реактива Гриса I (интенсивно встряхивали);
4) через 10 мин приливали 50 мкл реактива Гриса II;
5) белковый осадок отделяли центрифугированием в течение 10 мин (скорость вращения 10000 об/мин);
6) раствор над осадком переносился в оптическую кювету с длиной оптического пути 1 см и объемом 1 мл, затем доливали 0,8 мл дистиллированной H₂O;
7) регистрировали оптическую плотность раствора на длине волны 540 нм;
8) количество нитрита рассчитывали из калибровочного графика.

Определение нитрата:
1) в пробирку Эппендорф добавляли 50 мкл образца (в нулевой раствор добавляли 50 мкл реакционного буфера);
2) приливали 25 мкл раствора NADH (интенсивно перемешивали);
3) добавляли 25 мкл раствора нитратредуктазы;
4) инкубировали при t = 37^oC в течение 40 мин;
5) далее выполняли пункты 3-8 для определения нитрита;
6) количество нитрата рассчитывали по разности между вторым и первым определением нитрита.

На фиг. 2 представлен калибровочный график определения нитрита.

На фиг. 2а представлен калибровочный график определения нитрата.

Группа L-NAME.

На фоне введения ингибитора NOS содержание нитритов и нитратов в плазме крови опытной и контрольной подгрупп недостоверно снизилось. После инъекции нитрита натрия содержание обоих ионов в плазме резко возросло, (количество нитрита увеличилось на 344 ± 68 мкМ в опыте и на 362 ± 73 мкМ в контроле, а нитрата - на 87 ± 15 мкМ опыте и на 76 ± 16 в контроле). Введение перфторана опытной подгруппе привело к достоверному изменению нитрит-нитратного баланса крови. Так, содержание нитрита понизилось на 220 ± 40 мкМ, а содержание нитрата увеличилось на 157 ± 12 мкМ. В контрольной подгруппе вливание раствора КГ привело к незначительному (33 ± 13 мкМ) снижению содержания нитрита и нитрата в плазме.

На фиг. 3 представлено изменение концентрации нитрита и нитрата в ходе эксперимента в опытной группе L-NAME.

На фиг. 4 представлено изменение концентрации нитрита и нитрата в ходе эксперимента в контрольной группе L-NAME.

Группа FC
Введение перфторана опытной подгруппе также привело к изменению нитрит-нитратного баланса крови. На фоне увеличения содержания нитрита на 49 ± 6 мкМ, концентрация нитрата снизилась на 23 ± 8 мкМ. В результате суммарное содержание продуктов окисления NO увеличилось. В контрольной подгруппе введение КГ привело к равномерному незначительному снижению концентрации обоих ионов на 7±4 мкМ. Поэтому суммарное количество нитрита и нитрата в крови незначительно уменьшается.

Таким образом, в обеих сериях экспериментов введение в кровь новой фазы с более высоким значением коэффициентов распределения Q приводило к ускорению окисления NO. В группе NAME собственный синтез NO под действием NO-синтаз был заингибирован и NO мог образоваться только при восстановлении введенного нитрита и тионитритов, получающихся при одноэлектронном окислении NO в присутствии тиолов крови. Активация одноэлектронного окисления NO под действием перфторана приводила к возрастанию содержания тионитритов и, следовательно, к ускорению синтеза NO при их восстановлении. Образующийся таким образом NO конкурентно окислялся комплексом гемоглобин-кислород и другими Fe-содержащими комплексами в нитрат, поэтому концентрация нитрита уменьшалась, а концентрация нитрата росла. В отсутствии ингибитора NO-синтаз и экзогенного нитрита введение перфторана приводило к ускорению одноэлектронного окисления NO, при этом концентрация нитрита росла, а концентрация нитрата, образующегося в конкурентной реакции, падала. Пример показывает возможность практической реализации изобретения для ускорения окисления NO в крови.

На фиг. 5 представлено изменение концентрации нитрита и нитрата в ходе эксперимента в опытной группе FC.

На фиг. 6 представлено изменение концентрации нитрита и нитрата в ходе эксперимента в контрольной группе FC.

Литература
1. Liu, X., Miller, M.J.S., Joshi, M.S., Thomas, D.D. and Lancaster, J. R., Jr. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2175- 2179.

2. Gordin, V.A. and Nedospasov, A.A. (1998) FEBS Letters 424, 239-242.

3. Gow, A.J. and Stamler, J.S. (1998) Nature 391, 169-173.

4. Mayer, В. and Hemmens, B.N. (1997) Trends Biochem. Sci. 22, 477-481.

5. Nedospasov, A.A. (1998) Biochemistry (Moscow) 63, 881-904.

6. Kuhl, S.J. and Rosen, H. (1998) West. J. Med. 168, 176-181.

7. Pryor, W. A. and Squadrito, G.L. (1995) Am. J. Physiol. 268, L699-L722.

8. Xie, К. and Fidler, I.J. (1998) Cancer Metastasis Rev 17, 55-75.

9. Gorbunov, N.V., Tyurina, Y.Y., Salama, G., Day, B.W., Claycamp, H.G., Argyros, G. , Elsayed, N.M. and Kagan, V.E. (1998) Biochem. Biophys. Res. Comman. 244, 647- 651.

10. Darley-Usmar, V. , Wiseman, H. and Halliwell, B. (1995) FEBS Lett 369, 131-135.

11. Stuehr, D.J. (1997) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol 37, 339-359.

12. Liu, X., Miller, M.J.S., Joshi, M.S., Sadowska-Krowicka, H., Сlark, D.A. and Lancaster, J.R., Jr. (1998) J. Biol. Chem. 273, 18709-18713.

13. Reutov, V. P., Sorokina, E.G. and Kaiushin, L.P. (1994) Vopr. Med. Khim. 40(6), 31-35.

14. Singh, R. J. , Hogg, N., Joseph, J. and Kalyanaraman, B. (1996) J. Biol. Chem. 271, 18596-18603.

15. Kashiba-lwatsuki, M.,. Kitoh., К, Kasahara, E., Yu, H., Nisikawa, M. , Matsuo, M. and Inoue, M. (1997) J. Biochem. (Tokyo) 122, 1208-1214.

16. Whittle, B.J. (1995) Histochem. J. 27, 727-737.

17. Beda, N.V., Suntsova, T.P. (1999) FEBS Letters 453, 229-235.

18. Patent USA 5726209 (1998) "Liquid Fluorcarbon Emulsion as a Vascular Nitric Oxide Reservoir".

Изобретение относится к ускорению реакции оксида азота в гетерогенных средах, в т.ч. плазме крови, добавкой гидрофобных фторсодержащих соединений и может найти применение в медицине для коррекции состояний, связанных с нарушением метаболизма оксида азота. Сущность изобретения состоит в том, что в реакционную смесь вводят компонент(ы), вызывающие образование одной или нескольких новых фаз, так чтобы значение выражения

где Н - ускорение реакции; k_i - константа скорости реакции в i-й фазе, Q_NO,i, - равновесные коэффициенты распределения NO и O₂ в i-й фазе; x_i - доля i-й фазы в общем объеме, возросло, при этом добавляемый компонент(ы) содержи(а)т перфторуглеводород, или галогензамещенное производное перфторуглеводорода, или перфторалкиламин, или раствор белка, солюбилизировавшего фторсодержащее органическое вещество со значением Q_NO и/или в двухфазной системе с водой, более высоким, чем максимальное из значений Q_NO и/или для произвольной пары фаз реакционной смеси до добавления, а гетерогенной средой является плазма крови. Изобретение позволяет ускорить реакцию одноэлектронного окисления оксида азота в изначально гетерогенной системе, не изменяя ни количеств реагирующих веществ, ни температуры и давления в системе. 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

1. Способ ускорения одноэлектронного окисления оксида азота (NO) кислородом в гетерогенной среде изменением состава реакционной смеси, заключающийся в том, что в реакционную смесь вводят компонент(ы), вызывающие образование одной или нескольких новых фаз, так чтобы значение выражения

где H - ускорение реакции;
k_i - константа скорости реакции в i-й фазе;
Q_NO,i, - равновесные коэффициенты распределения NO и O₂ в i-й фазе;
x_i - доля i-й фазы в общем объеме,
возросла. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вводимые компонент(ы) содержат перфторуглеводород. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что вводимые компонент(ы) содержат галогензамещенное производное перфторуглеводорода. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что вводимые компонент(ы) содержат перфторалкиламин. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что вводимые компонент(ы) содержат раствор белка, солюбилизировавшего фторсодержащее органическое вещество со значением Q_NO и/или в двухфазной системе с водой, более высоким, чем максимальное из значений Q_NO и/или для произвольный пары фаз реакционной смеси до введения. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гетерогенная среда является плазмой крови.