ФРАГМЕНТ ДНК ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N15/11 

Изобретение относится к области биотехнологии, генетической инженерии, и может найти применение в криминалистике при идентификации личности, установлении отцовства и материнства, а также в генетике и селекции живых организмов.

Известен олигонуклеотид (TCC)₅, применяемый в качестве зонда при идентификации живых организмов по способу, включающему выделение их ДНК, ее фрагментацию, фракционирование, гибридизацию с зондом и собственно идентификацию по результатам анализа полученной картины гибридизации (Epplen J.T. at.al. Hum. Genet., 1989, v. 82, p.227-233).

Однако картина гибридизации, получаемая при использовании данного известного зонда, недостаточно информативна, что снижает достоверность идентификации.

Известен фрагмент ДНК человека в составе рекомбинантной плазмиды (Шленский А.Б. автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук. - М. - 1993. - С. 34.).

Однако фрагмент ДНК человека, содержащийся в известной плазмиде, не позволяет получать достаточно информативные картины гибридизации и идентифицировать живые организмы, что делает актуальной задачу расширения ассортимента зондов, применяемых с этой целью.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является получение нового зонда, позволяющего получать высоко информативные картины гибридизации и тем самым повысить достоверность идентификации живых организмов.

Достигается это тем, что для использования в качестве зонда при идентификации живых организмов предложен фрагмент ДНК человека размером 485 п.н. , содержащий повторяющийся тринуклеотид TCC, имеющий строение, приведенное в конце формулы изобретения.

в котором участок узнавания рестриктазой Eco311 на расстоянии 460 п.н. от левого конца вставки; участки узнавания рестриктазой Gsu1 на расстоянии 154 и 308 п. н. от левого конца вставки; промоторы и участки, содержащие гены, отсутствуют.

На фигуре представлена физическая карта новой плазмиды pTCC1, в состав которой включен новый фрагмент ДНК человека. Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. В процессе получения фрагмента используют библиотеку геномной ДНК человека на фаге EMBL-3 (фирма Atlanta). Скрининг проводят с олигонуклеотидом (TCC)₅. Олигонуклеотид метят ( γ - ³²P) ATP с помощью полинуклеотидкиназы фага T4 по следующей методике: 5 мкл (1-50 нМ) олигонуклеотида (TCC) 40 мкл воды, 5 мкл буфера (500 мМ трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ MgCl, 50 мM DTT, 1 мM спермидина, 1 мМ ЭДТА), 50 мКи ( γ - ³²P) - ATP 1 мкл полинуклеотидкиназы T4 при 37^oC 1 час. В работе используют штамм E.coli LE392 (F^-, hsdR514[r_k - , m_k-] , su⁺, supE44, supF58, lacY1, galK2, galT22, metB1, trpR55, λ -). Фаговую библиотеку, разводят в SM буфере (50 мМ трис-HCl pH 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgSO, 0.01%-ный желатин) и высевают с 3 мл расплавленного верхнего агара (0.7%-ная агароза в питательном бульоне) с добавлением клеток E. coli LE392. Клетки готовят следующим образом: штамм растят до стационарной фазы, затем осаждают и разводят в 0.01 М MgSO до концентрации 1.5•10⁹ кл./мл. Высев производят на застывший 1.5%-ный бакто-агар с питательным бульоном. Чашки инкубируют при 37^oC 3-8 часов до образования бляшек фаголизатов. Реплики получают на нитроцеллюлозных фильтрах фирмы Schleicher and Schuell BA 85, путем наложения их на чашки Петри с фаговыми бляшками.

Отпечатки затем лизируют в денатурирующем растворе (0.5 М NaOH, 1.5 М NaCl) в течение 5 мин, затем в нейтрализующем растворе (0.5 М Мтрис-HCl, 1.5 М NaCl) 5 минут. ДНК закрепляют на фильтрах запеканием при 80^oC. Условия гибридизации олигонуклеотида (TCC)₅, меченного ( γ - ³²P)-ATP, с фильтрами репликами, рассчитанные согласно Nucleic acid hybridisation Hames A., Higgins A., 1985., гл. 4.1, составляют: 37^oC 6 часов в растворе, содержащем 5-кратный SSC, 5 мМ EDTA, 5-кратный Денхардт раствор, 0,1%-ный SDS. После гибридизации фильтры отмывают в 4-кратном SSC при 37^oC 2 часа. Радиоавтографию проводят на рентгеновской пленке PM-B в течение нескольких суток.

Отбирают наиболее яркие сигналы на радиоавтографах. Эллюируют соответствующие фаговые бляшки на чашках Петри и консервируют в SM буфере.

Фрагмент ДНК человека тринуклеотидным повтором TCC выделяют с помощью рестриктазы Sau3A из ДНК фага, дающего наиболее яркий сигнал на радиоавтографе. ДНК фага выделяют из ночной культуры с лизированными клетками. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 6000 g. Клеточную ДНК и РНК обрабатывают ДНК-зой и РНК-зой при температуре 37^oC в течение 1 часа. Фаговые частицы осаждают с помощью водного раствора, содержащего 20%-ный ПЭГ, 2.5 М NaCl, при ускорении 10000 g в течение 5 минут. ДНК выделяют фенольной обработкой с последующим переосаждением спиртом. (Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск, 1990 с. 7-8). Рестриктированную ДНК разделяют на 0,8%-ной агарозе с помощью электрофореза. Участок вставки с тринуклеотидным повтором эллюируют из агарозы выдавливанием на центрифуге.

Пример 2. Переклонирование в плазмиду осуществляют с помощью вектора Puc19 с BamHI липкими концами. Лигирование проводят в 20 мкл 1-кратного буфера для лигирования (10 мМ трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ MgCl, 10 мМ DTT, 0,0025 мМ ATP) при 12^oC 12 часов. В реакцию брали 10 ед. T4 ДНК-лигазы.

Трансформацию лигированного материала осуществляют в компетентные клетки штамма HB101 E.coli [F-, hsdS20(r_B-, m_B-), recA13, ara - 14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(Sm^r), xyl-5, mtl-1, supE44, λ -]. Селекция рекомбинантных клонов проведена с использованием ИПТГ и X-gal на 1,5% бакто-агаре с ампициллином (50 мкг/мл).

Селектированный клон подращивают в течение ночи в питательном бульоне с ампициллином (50 мкг/мл). Бактериальные клетки осаждают на микроцентрифуге в течение 1 мин. Осадок ресуспендируют в 200 мкл STET буфера (8%-ная сахароза, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ ЭДТА, 0,1%-ный тритон X-100) и инкубируют 5 мин после добавления 4 мкл лизоцима (50 млг/млл). Кипячением в течение 45 сек и последующим осаждением на микроцентрифуге (10 мин) удаляют бактериальную ДНК. В раствор добавляют СТАВ (5%-ный) до конечной концентрации 0,5%-ов. После перемешивания центрифугируют 5 мин на микроцентрифуге. Осадок ресуспендируют в 300 мкл 1,2 М NaCl. Добавляют 750 мкл этанола и центрифугируют на микроцентрифуге 10 мин. ДНК растворяют в 20 мкл воды.

В результате получают растворенную в воде плазмиду pTCC1, содержащую фрагмент ДНК человека с повторяющимся тринуклеотидом TCC.

Пример 3. Выделение ДНК из крови и тканей идентифицируемых живых организмов проводят известными методами.

ДНК обрабатывают рестриктазами в стандартных условиях при 37^oC в течение 12 часов. Электрофорез проводят в горизонтальном 1%-ном агарозном геле при напряженности поля 0,8 В/см 16-20 часов. ДНК, фракционированную в агарозном геле, переносят на нитроцеллюлозные фильтры по методу Саузерна. Гибридизацию проводят с высокомеченными одноцепочечными пробами на основе плазмиды pTCC1.

Высокомеченную пробу на основе плазмидного зонда pTCC1 получают с использованием рассеянной затравки. Предварительно плазмиду обрабатывают рестриктазой EcoRI, для получения релаксированной формы ДНК. Удельная активность проб составляет 10⁹ имп/мин/мкг. Перед гибридизацией пробу денатурируют в кипящей воде в течение 2 минут. Гибридизацию проводят при 60^oC 18-24 часа, в том же буфере, что и гибридизацию олигонуклеотидов с фильтрами репликами фаговых бляшек. Удельная активность пробы в растворе составляет 1-3•10⁶ имп/мин/млл.

Отмывку осуществляют при 60^oC в 2-кратном SSC, 0,1%-ном SDS 2 часа. Методом радиоавтографии на рентгеновской пленке PM-B осуществляется детекция полиморфных последовательностей ДНК.

Пример 4. ДНК обрабатывают рестриктазой MvaI. По методике примера 3 получают картины гибридизации для отца, матери и ребенка. У отца и матери наборы полос сильно отличаются, как и должно быть для двух неродственных индивидуумов. Ребенок имеет половину гибридизационных полос от матери, половину от отца. Это согласуется с Менделевским характером наследования полос. Зонд pTTC1 показывает 6-10 полос в области 9-25 т.п.н. и годен для криминалистических исследований.

Пример 5. ДНК отца матери и ребенка обрабатывают рестриктазой PstI. По способу согласно изобретению, получают картины гибридизации, согласующиеся с Менделевским типом наследования полос.

Пример 6. Исследуют три линии одного вида мышей (M. musculus). Используя в качестве зонда новую плазмиду pTCC1, получают различные картины гибридизации. В то же самое время ДНК особей одной линии дают одинаковые картины гибридизации.

Использование: биотехнология, генетическая инженерия, криминалистика, генетика. Сущность изобретения: фрагмент ДНК человека для идентификации живых организмов размеров 485, п.н. содержит повторяющийся тринуклеотид ТСС и имеет участок узнавания рестриктазой Есо311 на расстоянии 460 п.н. от левого конца вставки, участки узнавания рестриктазой Gsu1 на расстоянии 154 и 308 п.н. от левого конца вставки. 1 ил.

Фрагмент ДНК человека для идентификации живых организмов, включающий повторяющийся тринуклеотид ТСС, имеющий следующее строение приведенное на с.

содержащий участок узнавания рестриктазой E со 311 на расстоянии 460 п. н. от левого конца вставки; участки узнавания рестриктазой Gsu 1 на расстоянии 154 и 308 п. н. от левого вида вставки, не содержащий промоторы и участки генов.