СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ГОНОРЕИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/571 

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам прогнозирования течения инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта.

В частности, способ предназначен для прогнозирования затяжного течения урогенитальной инфекции, зтиологическим агентом которой является гонококк (Neisseria gonorrhoeae), а также направлен на оценку вероятности возникновения инфекционно- воспалительных осложнений при урогенитальной гонорее.

Задача прогнозирования течения урогенитальной гонореи определяется необходимостью планирования тактики ее лечения и целесообразностью обоснования своевременных профилактических мероприятий по предупреждению развития разнообразных осложнений.

Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в бактериологических лабораториях кожно- венерологических диспансеров, решающих вопросы диагностики и эффективного лечения больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта гонококковой этиологии.

Уровень техники.

Первые попытки решения проблемы прогнозирования характера течения гонококковой инфекции были связаны с анализом клинических особенностей данного заболевания при первичном осмотре. Так затяжное течение и хронизация с некоей долей вероятности могут прогнозироваться при изначально минимальной активности процесса, например - при свежей торпидной гонорее (Туранова Е.Н., Частикова A.B., Антонова Л.В. Гонорея женщин. -М.: Медицина, 1983. -144 с.).

Очевидными недостатками подобного подхода являются субъективность и малая точность прогноза.

В этой связи дальнейшие попытки создания методов прогнозирования были связаны с анализом напряженности системного и местного иммунитета, при этом основное значение уделялось анализу системы комплемента, играющей ключевую роль в санации организма при гонококковой инфекции (Ross S.C., Densen P. Complement deficiency states and infection: epidemiology, pathogenesis and consequenses of neisserial and other infections in an immun deficiency//Medicin (Baltimore).-1984.-V. 63. -P. 243-273). Соответственно, обнаружение дефектов системы комплемента может рассматриваться в качестве прогностически неблагоприятного признака, коррелирующего с хронизацией инфекционного процесса и развитием разнообразных осложнений (способ - прототип 1).

Использование данного метода, наряду с его высокой эффективностью в случае обнаружения генетически обусловленных дефектов системы комплемента, в значительном проценте случаев позволил констатировать вторичный характер подавления его активности, зависимый от биологических характеристик возбудителя. В этой связи следует указать, что ранее на примере гнойно- воспалительных заболеваний микробной этиологии (преимущественно хирургических инфекций) нами была продемонстрирована роль способности патогенов к инактивации комплемента - "антикомплементарной активности" - как патогенетически значимого фактора, определяющего неблагоприятное и затяжное течение патологического процесса (Патент РФ N 2111493 "Способ прогнозирования неблагоприятного течения гнойно-воспалительных заболеваний микробной этиологии").

Подобный способ по совокупности признаков может быть признан наиболее близким к заявляемому (способ - прототип 2). Очевидно, что тестирование антикомплементарной активности и у N.gonorrhoeae при установлении соответствующих количественных критериев также может в некоторой степени решить проблему прогнозирования течения гонококковой инфекции. Однако, в этом случае неизбежно появление ошибочных прогностических заключений, обусловленных "просмотром" первичных врожденных или приобретенных дефектов системы комплемента.

Таким образом, основной причиной, препятствующей получению требуемого результата, является невысокая информативность раздельного тестирования активности системы комплемента и противостоящей ей антикомплементарной активности Neisseria gonorrhoeae. Соответственно, отсутствие комплексного подхода к анализу взаимоотношений в системе "комплемент - антикомплементарная активность" при гонококковой инфекции ведет к формированию значительного процента прогностических ошибок (до 15-30%).

Подводя итог данному разделу описания изобретения, следует указать, что заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.

Сущность изобретения.

Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является повышение точности прогнозирования течения урогенитальной гонореи.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее:
- взаимоотношения, складывающиеся при урогенитальной гонорее в системе "комплемент репродуктивного тракта - антикомплементарная активность N.gonorrhoeae", являются наиболее информативным параметром, позволяющим осуществлять прогнозирование особенностей дальнейшего течения инфекционно-воспалительного процесса.

Соответственно, при реализации заявляемого способа прогнозирования неблагоприятного течения урогенитальной гонореи характеристика действий, порядка их выполнения и условий осуществления представляется следующим образом:
На первом этапе ложкой Фолькмана, вмещающей 0,1 мл жидкости, осуществляют забор отделяемого уретры (у мужчин) или цервиковагинального секрета (у женщин); полученный материал помещают в герметическую посуду и хранят не более 3 суток при температуре от -5^oC до -10^oC. Параллельно из патологического материала (отделяемое уретры, цервикального канала) одним из общепринятых методов выделяют чистую культуру возбудителя, которую по совокупности культуральных, тинкториальных и биохимических признаков идентифицируют до вида - N.gonorrhoeae. После положительного результата идентификации выделенную культуру выращивают в 2-3 мл жидкой питательной среды при 37^oC в течение 24 часов.

Содержание этапа - получение материала для исследования.

Общая продолжительность этапа - 2-3 суток.

На втором этапе к отделяемому уретры или цервиковагинальному секрету (каждый в объеме 0,1 мл) добавляют равный объем изотонического раствора хлорида натрия, полученную смесь гомогенизируют интенсивным пипетированием и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин для получения оптически прозрачного супернатанта, содержащего компоненты системы комплемента. Параллельно проводится центрифугирование выращенных на жидкой питательное среде исследуемых культур N.gonorrhoeae (3000 об/мин, 15 минут) для получения супернатантов, содержащих антикомплементарный фактор гонококков.

Содержание этапа - подготовка материала к исследованию.

Продолжительность этапа - 30 мин.

На третьем этапе в лунки микропанели (используются планшеты с плоским дном, что необходимо для последующей аппаратной регистрации результата исследования) вносят:
1) по 20 мкл супернатанта уретрального или цервиковагинального секрета (серия А - тестирование активности местной системы комплемента репродуктивного тракта при урогенитальной гонорее);
2) в соседние лунки вносят по 10 мкл супернатанта выделенной от того же пациента культуры N.gonorrhoeae + 10 мкл комплемента сыворотки морской свинки, предварительно оттитрованного таким образом, что его активность соответствует минимальному содержанию комплемента, достаточному для достижения 100% гемолиза (серия Б - тестирование антикомплементарной активности возбудителя урогенитальной гонореи);
3) после заполнения микропанели во все лунки вносят по 20 мкл оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана в концентрации 1,5•10⁸ кл/мл на изотоническом веронал-мединаловом буфере (pH 7,4), 0,0025 М хлорида магния и 0,00075 М хлорида кальция, после чего планшеты инкубируют при 37^oC в течение 60 минут.

Содержание этапа - реализация активности компонентов системы "комплемент-антикомплемент" в индикаторной гемолитической системе. Продолжительность этапа - 90 мин."
На четвертом этапе с использованием фотометра с вертикальным ходом лучей и светофильтра 600-640 нм, исключающего погрешность измерения, связанную с поглощением гемоглобина, проводят замер оптической плотности остаточных (нелизированных с участием комплемента) эритроцитов. Учет результатов проводят по проценту гемолиза, рассчитанного относительно контролей 0% и 100% гемолиза:
1) активность системы комплемента репродуктивного тракта при урогенитальной гонорее оценивают величиной, соответствующей проценту гемолиза по отношению к контролю - 0% гемолиза;
2) антикомплементарную активность возбудителя урогенитальной гонореи (N. gonorrhoeae) оценивают величиной, соответствующей разности между 100% гемолизом и процентом гемолиза, сформировавшимся в присутствии внеклеточных продуктов гонококков с антикомплементарными свойствами.

Содержание этапа - регистрация значений активности компонентов "комплемент-антикомплемент".

Продолжительность этапа - 2 мин.

На пятом этапе проводится вычисление соотношения активности местной системы комплемента репродуктивного тракта и антикомплементарной активности возбудителя - N.gonorrhoeae по формуле: антикомплементарная активность/активность комплемента (АКА/Компл. ), при этом прогностическая интерпретация результата в случае получения значений данного соотношения <1 заключается в ожидании непродолжительного неосложненного течения заболевания, а при значениях соотношения ≥ 1 прогнозируется затяжное течение урогенитальной гонореи с вероятностью возникновения инфекционно- воспалительных осложнений.

Возможность получения технического результата в указанных интервалах значения определяемых соотношений АКА/Компл. определяется следующим комплексом причинно-следственных связей (таблица 1).

Приведенные в таблице 1 результаты определения соотношений АКА/Компл. свидетельствуют о низких значениях данного параметра в случаях благоприятного и высоких - неблагоприятного течения урогенитальной гонореи, что отражает патогенетическую значимость "комплемент - антикомплемент" при определении особенностей клинической картины данного заболевания. В частности, значения соотношения АКА/Компл. в интервале от 0 до 0,99 были установлены в 95,9% случаев неосложненной и лишь 12,5% случаев осложненной гонореи. Соответственно значения, равные или более 1, были констатированы лишь в 4,1% случаев неосложненной и 87,5% осложненной гонореи. Выявленные яркие дифференцирующие различия определяют возможность получения положительного эффекта от применения заявляемого способа (правильного прогностического результата) в целом в 94,6% от общего количества проанализированных случаев. Таким образом, погрешность прогнозирования находится на уровне 5%, что существенно ниже аналогичных показателей в способах-прототипах.

При этом повышение (до 1,5 и выше) или понижение (до 0,5 и ниже) пороговых значений соотношения АКА/Компл. ведет к значительному увеличению ошибки прогнозирования. Таким образом, из невозможности получения результата в других интервалах значений соотношения АКА/Компл., обоснованные пороги прогностического заключения должны быть установлены на уровне <1,0 для случаев благоприятного и > 1,0 - неблагоприятного течения урогенитальной гонореи.

В целом, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа; характеристике действий, порядке их выполнения и условий осуществления, а также обосновании критериев интерпретации получаемого при его выполнении результата, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и должен быть оценен как соответствующий критерию изобретательский уровень.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Для проведения прогнозирования течения урогенитальной гонореи из патологического материала (отделяемое уретры, цервикального канала) одним из общепринятых методов выделяют чистую культуру возбудителя, которую идентифицируют до вида N.gonorrhoeae; параллельно ложкой Фолькмана, вмещающей 0,1 мл жидкости, осуществляют забор отделяемого уретры (у мужчин) или цервикального секрета из заднего свода влагалища (у обследуемых женщин).

В дальнейшем, последовательность выполнения действий при осуществлении заявляемого способа, их условия и режимы являются следующими:
1) Бактерии выращиваются в 2-3 мл жидкой питательной среды при 37^oC в течение 24 часов.

2) Выращенные культуры подвергаются центрифугированию (3000 об/мин, 15 минут), супернатанты культур отделяются.

3) Параллельно проводится центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 мин гомогенизированной смеси отделяемого уретры или цервиковагинального секрета с изотоническим раствором хлорида натрия (1:1) для получения оптически прозрачного супернатанта.

4) В лунки микропанели вносят по 20 мкл супернатанта уретрального или цервиковагинального секрета, в соседние лунки вносят по 10 мкл супернатанта, выделенной от того же пациента культуры N.gonorrhoeae с добавлением 10 мкл комплемента сыворотки морской свинки, оттитрованного до его минимального разведения, вызывающего 100% гемолиз в используемых экспериментальных условиях.

5) После заполнения микропанели во все лунки вносят по 20 мкл оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана в концентрации 1,5•10⁸ кл/мл, 0,0025 М хлорида магния и 0,00075 М хлорида кальция, после чего планшеты инкубируют при 37^oC в течение 60 мин.

б) Измерение оптической плотности оставшихся негемолизированных эритроцитов производят с использованием фотометра с вертикальным ходом луча при 600-640 нм.

7) Активность системы комплемента мочеполового тракта оценивают величиной, соответствующей проценту гемолиза по отношению к контролю - 0% гемолиза.

8) Антикомплементарную активность N.gonorrhoeae оценивают величиной, соответствующей разности между 100% гемолизом и процентом гемолиза, сформировавшимся в присутствии внеклеточных продуктов возбудителя с антикомплементарными свойствами.

9) Проводится вычисление соотношения активности комплемента и антикомплементарной активности.

Пример 1. У больного З., 32 лет (амбулаторная карта ОКВД N1378 за 1997 год) с диагнозом "Свежая гонорея. Подострый передний уретрит" на седьмой день заболевания при первичном обращении был осуществлен забор отделяемого из уретры в пробирку в равных объемах с 0,9% изотоническим раствором натрия хлорида и на поверхность 1,5% мясопептонного агара с добавлением 2% дрожжевого аутолизата, 2% гидролизата козеина, 20% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (полимиксина М сульфата - 20 ЕД/мл среды и линкомицина гидрохлорида - 2 мкг/мл), где после 24-часовой инкубации при 37^oC сформировались колонии микроорганизмов, дающих положительную цитохромоксидазную реакцию. Типичные колонии были выделены в чистой культуре и по совокупности морфологических (бобовидные диплококки, расположенные друг к другу вогнутыми сторонами, наружные стороны кокков выпуклые), тинкториальных (отрицательные при окраске по Граму), биохимических (ферментирующие глюкозу при отсутствии ферментадии прочих субстратов в диагностической тест-системе MicroLa Test- Lachema, Чехия) свойств идентифицированы как нейссериальный гонококк (Ne- isseria gonorrhoeae). C целью уточнения прогноза течения заболевания у выделенной культуры была определена антикомплементарная активность. Параллельно в отделяемом уретры была определена активность системы комплемента. Для этого бактерии были выращены в 3 мл мясо-пептонного бульона с добавлением 2% гидролизата козеина, 2% дрожжевого аутолизата и 20% сыворотки крупного рогатого скота (при 37^oC, 24 часа). В лунки микропанели были внесены супернатант уретрального секрета в дозе 20 мкл и супернатант культуры в дозе 10 мкл с добавлением 10 мкл комплемента сыворотки морской свинки. После внесения в каждую из этих лунок также 20 мкл сенсибилизированных эритроцитов барана планшета инкубировалась при 37^oC в течение 60 минут. Планшета сканировалась на денситометре ДМ-1 со светофильтром N4 (600-640 нм). После определения уровня антикомплементарной активности выделенного штамма (подавление 7,60% от 100% активности исходного комплемента) и активности местной системы комплемента (гемолиз 9,52% сенсибилизированных эритроцитов), проведено вычисление соотношения полученных величин по формуле: антикомплементарная активность/активность комплемента. Таким образом, определение значения данного соотношения - 0,798 (т.е.<1) в соответствии с формулой заявляемого изобретения позволяет в данном случае прогнозировать непродолжительное неосложненное течение воспалительного процесса.

Дальнейшее течение заболевания подтвердило правильность прогностического заключения, сделанного с использованием заявляемого способа. После однократного курса антибиотикотерапии состояние больного характеризовалось полным клиническим улучшением (выздоровлением), в контрольных мазках и посевах уретрального отделяемого гонококки отсутствовали. После минимального срока клинико- лабораторного наблюдения (2-кратные отрицательные результаты бактериологического исследования с интервалом 1 месяц) больной снят с учета.

Пример 2. Больная П. , 31 г., обратилась в ОКВД (амбулаторная карта N 5075 за 1996 год) с жалобами на скудные слизистые выделения из половых путей. Больна 1,5 месяца, самостоятельно не лечилась. Возникновение заболевания связывает с половым контактом. В посеве выделений из уретры и шейки матки выделен гонококк. С диагнозом "Свежая гонорея". Торпидный уретрит, эндоцервицит" больной был назначен курс антибактериальной терапии. С целью уточнения прогноза заболевания в цервиковагинальном секрете была определена функциональная активность комплемента, а у выделенной культуры N.gonorrhoeae, проявляющей типичные морфологические, тинкториальные и биохимические свойства, была определена антикомплементарная активность, для чего были произведены действия, аналогичные описанным в предыдущем примере. В результате соотношение антикомплементарной активности и активности комплемента было установлено на уровне 2,7, что согласно заявляемому способу выше установленного порога (>1) и в соответствии с формулой изобретения позволяет прогнозировать с высокой вероятностью развитие хронизации процесса с инфекционно-воспалительными осложнениями.

Течение периода клинико-лабораторного наблюдения подтвердило правильность прогноза, полученного с помощью заявляемого способа. При проведении второго после лечения клинико-лабораторного контроля при бактериологическом исследовании в отделяемом уретры и шейки матки вновь были выявлены гонококки. С диагнозом "Хроническая гонорея. Уретрит, эндоцервицит, двухсторонний аднексит" больной был назначен дополнительный курс антибактериальной терапии с использованием препаратов, воздействующих на неспецифическую реактивность организма и местного лечения. Клинико-лабораторное наблюдение у этой больной, таким образом, продлилось до 4-х месяцев.

Обобщенная проверка прогностической точности заявляемого способа при его сопоставлении со способами-прототипами 1 и 2 была проведена ретроспективно по результатам клинического наблюдения и динамического лабораторного исследования 56 пациентов, у которых на первичном приеме был установлен диагноз свежей гонореи. Полученные данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой эффективности заявляемого способа, выразившейся в значительном снижении ошибки прогнозирования: с 16,1-28,6% (при использовании способов-прототипов) до 5,4% случаев (предлагаемый способ).

Таким образом, положительный результат, полученный при использовании заявляемого способа, выступает в виде повышения точности прогнозирования неблагоприятного течения урогенитальных заболеваний гонококковой этиологии. В дальнейшем при получении неблагоприятного прогноза, включение в схему лечения превентивных мероприятий позволяет предупредить развитие инфекционно- воспалительных осложнений и затяжное течение гонореи. Следовательно, конечным результатом использования заявляемого способа является повышение качества лечения больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта.

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, а именно к способам прогнозирования течения инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования течения урогенитальной гонореи. Оценивают соотношение антикомплементарной активности гонокока, определяемое процентом подавления комплементзависимого гемолиза эритроцитов в присутствии эталонного количества сывороточного комплемента, вызывающего 100% гемолиз, а также активности местной системы комплемента мочеполового тракта, определяемое процентом гемолиза сенсибилизированных эритроцитов. При этом исследуемые штаммы N.gonorrhoeae выращивают в жидкой питательной среде и отделяют супернатант, который вносят в лунки микропанели с добавлением комплемента сыворотки морской свинки, оттитрованного до его минимального разведения, вызывающего 100% гемолиз. В параллельные ряды лунок микропанели вносят оптически прозрачный супернатант отделяемого уретры или цервиковагинального секрета, полученных от тех же пациентов. После заполнения микропанели во все лунки вносят оптимально сенсибилизированные эритроциты барана. На завершающем этапе выполнения способа проводят регистрацию процента подавления активности комплемента (антикомплементарную активность) и процента гемолиза под действием комплемента репродуктивного тракта, после чего вычисляют соотношение полученных величин и при его значении менее 1 ожидают непродолжительное и/или неосложненное течение заболевания, а при значении соотношения, большем или равном 1, прогнозируют затяжное течение заболевания с вероятностью возникновения инфекционно-воспалительных осложнений. 2 табл.

Способ прогнозирования течения урогенитальной гонореи путем исследования взаимодействия возбудителя (гонококка) с системой комплемента, отличающийся тем, что оценивают соотношение антикомплементарной активности гонококка, определяемое процентом подавления комплементзависимого гемолиза эритроцитов в присутствии эталонного количества сывороточного комплемента, вызывающего 100% гемолиз, а также активности местной системы комплемента мочеполового тракта, определяемое процентом гемолиза сенсибилизированных эритроцитов, которое вычисляют по формуле

и при значении данного соотношения менее 1 ожидают продолжительное и/или неосложненное течение заболевания, при значениях соотношения, большем или равном 1, прогнозируют затяжное течение заболевания с вероятностью возникновения инфекционно-воспалительных осложнений.