Способ изготовления жидких стерильных питательных сред для работы с клетками млекопитающих Российский патент 2017 года по МПК C12N5/02 B01F11/02 B01F1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа изготовления жидких стерильных питательных сред для работы с культурами клеток млекопитающих.

Проблемы, сопровождающие процессы производства готовых стерильных сред, состоят, с одной стороны, в способе стерилизации, обеспечивающем возможность их надежного долгосрочного хранения, с другой, в исчерпывающем растворении всех компонентов, среди которых присутствуют реагенты, концентрация которых в литре готовой среды не превышает 1-го мг. При длительном хранении смесей сухих компонентов даже в условиях контролируемой влажности практически неизбежны процессы спекания, что при использовании традиционных способов растворения и последующей стерилизующей фильтрации приводит к потере минорных по весу компонентов среды. Изготовление жидких сред из смесей, не подвергающихся длительному хранению, решает эту проблему, но существенным образом повышает риски, связанные с хранением и транспортировкой жидких растворов, сказываясь и на экономической стороне.

Известен способ получения питательной среды для культур клеток животных, включающий растворение органических компонентов среды в готовых солевых растворах Эрла или Хэнкса, с последующей стерилизацией [1].

Известен способ получения питательной среды для культивирования клеток животных, включающий смешивание стерильных растворов Хэнкса, 5%-го раствора гидролизата лактальбумина и сыворотки КРС, с последующей стадией фильтрации и повторной стерилизации [2].

Описанные аналоги предусматривают использование уже готовых стерильных сред в технологиях получения новых сред, что неоправданно утяжеляет как с технологической, так и с экономической точки зрения технологии их изготовления.

Известен способ получения жидкой стерильной питательной среды для культивирования клеток млекопитающих, предусматривающий стерилизацию предварительно подготовленных сухих смесей компонентов ускоренными электронами. Полученные подобным способом стерильные компоненты впоследствии растворяют в стерильной очищенной воде [3].

Описанный способ подлежит критике в первую очередь с позиции существенного усложнения работы с клетками, так как предусматривает необходимость соблюдения специальных условий в процессе растворения сухих компонентов. При этом следует учесть то, что эффективность питательной среды зависит от степени исчерпывающего растворения компонентов и, как правило, требует дополнительной фильтрации, что практически невозможно в данном способе.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом - является способ получения жидкой стерильной питательной среды, включающий последовательное растворение нестерильных компонентов: неорганических солей, глюкозы, гидролизата казеина, витаминов, фенолового красного и бикарбоната натрия в нестерильной очищенной воде, добавление к полученной нестерильной питательной среде 10%-го раствора поливинилпирролидона, сыворотки КРС и антибиотиков. Стерилизация осуществляется фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм, после чего стерильные растворы сред расфасовывают во флаконы в асептических условиях [4].

Основными недостатками этого способа являются ограниченный срок годности жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов, который не превышает 6 месяцев при температуре 0-10°С. Кроме того, изготовление и хранение жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов экономически невыгодно, это касается и проблем логистики.

Основными задачами предлагаемого способа изготовления жидких стерильных питательных сред являются: обеспечение возможности работы с нестерильными компонентами, оптимизация количества получаемых сред в диапазоне объемов, фактически необходимых в данный момент времени. Это освобождает от необходимости обеспечивать строгие условия для хранения жидких сред и существенно снижает риски и ограничения, диктуемые временными рамками. Предлагаемый способ более привлекателен с экономической точки зрения.

Поставленные задачи решаются растворением заранее подготовленных стандартных фасовок смеси сухих компонентов в очищенной воде и непосредственно следующей за этим стерилизацией раствора. Исчерпывающее растворение достигается при помощи использования ультразвуковой ванны (УЗ). Могут быть использованы УЗ-ванны фирм HAKKO, ERSA, Proskit, S-line, Актаком, Сапфир с рабочими объемами от 1 до 100 литров. Время эффективного растворения зависит от объемов изготавливаемой среды и не превышает 10 минут. Стерилизующая ультрафильтрация осуществляется за счет применения мембранных фильтров. Требованиям эффективной стерилизующей ультрафильтрации удовлетворяет продукция любого из существующих производителей: Pall, Millipore, Aqua Filter, Sartorius, Soclema, Владипор.

Непосредственно перед работой в УЗ-ванну помещают необходимый объем очищенной воды (от 1-го до 100 литров в зависимости от рабочего объема ванны и требуемого для работы объема среды) и соответствующее количество смеси сухих компонентов сред. После 5-10-минутного цикла растворения готовая среда подается при помощи насоса в стерильный сосуд через систему стерилизующей ультрафильтрации. В ходе растворения в ванну добавляют все необходимые дополнительные нестерильные сухие компоненты в соответствии с задачами проводимой работы. Режим работы УЗ-ванны подбирают таким образом, чтобы не происходило выплескивания жидкости за счет кавитации. Так, например, при стандартной частоте УЗ-генератора 37 кГц резонансное состояние (условия образования кавитационных пузырьков в водных растворах) достигается в диапазоне амплитуд уз/волн от 5 до 20 микрон. Таким образом, любой параметр этого диапазона, не приводящий к выплескиванию жидкости из ванны за счет чрезмерного вспенивания, будет удовлетворять задачам исчерпывающего растворения. Состояние, при котором образуются кавитационные пузырьки, определяется визуально и по характерному резонирующему звуку. Предпочтительным является использование минимальных значений амплитуды, при которых наблюдается кавитация, как фактор, уменьшающий нагревание озвучиваемой смеси. Производительность насоса при ультрафильтрации задается в соответствии с рекомендациями изготовителя используемых фильтров. Надежность стерилизации обеспечивается за счет использования каскада, состоящего из трех последовательно расположенных фильтров с размером пор 0,45, 0,22 и 0,1 мкм. Используются стерильные фильтры заводского изготовления. Схема процесса представлена на рис. 1.

В разработанной технологии использовали УЗ-ванну Elmasonic S 40/(Н) производства компании Elma (Германия) и вакуумный насос WP6122050 Millipore (США).

В таблице 1 приведен состав среды α-МЕМ.

Состав среды представлен в качестве стандартного примера. Аналогичным образом выглядят модификации состава сред α-МЕМ, DMEM, F-12, RPMI-1640 и т.д.

Сущность изобретения. Смесь сухих компонентов среды растворяют в соответствующем объеме очищенной воды. После стерилизующей фильтрации непосредственно в ходе работы вносят требуемое количество необходимых добавок в виде стерильных растворов (сыворотка, антибиотики и др.). Использование готовых коммерческих смесей не требует никаких дополнительных процедур. В случае использования самостоятельно приготовленных сухих смесей для удобства фасовки предварительно навешивают стократное количество каждого компонента. Перед расфасовкой их подвергают 2-часовому измельчению и гомогенизации в шаровой мельнице (барабанный смеситель) до получения гомогенной, относительно мелкодисперсной массы, которую и фасуют в 100 пластиковых герметичных микроконтейнеров, каждый из которых содержит сухой смеси в количестве, необходимом для приготовления 1 литра среды (12,213 г для среды α-МЕМ). Все используемые компоненты имеют квалификацию «осч» - российского производства и/или соответствующую таковой - импортного.

В дальнейшем, требуемый объем среды изготавливается путем использования содержимого соответствующего количества контейнеров от 1 до 100 литров, кратно одному литру и из расчета 1 контейнер на 1 литр среды.

Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что для быстрого и эффективного растворения используют ультразвуковую ванну, позволяющую за счет кавитационных процессов быстро, 5-10 минут, получать гомогенный раствор солей, который после немедленной фильтрующей стерилизации и добавления требуемых стерильных компонентов готов к использованию в качестве среды для культивирования клеток млекопитающих. При этом количество получаемой среды соответствует требуемому для актуальной в данное время работы объему, что освобождает от необходимости хранить заблаговременно приготовленную или приобретенную среду в контролируемых условиях в течение неопределенного времени с возникновением рисков ее невостребованности и вынужденной утилизации по истечении сроков хранения или в связи с бактериальным проростом при ненадлежащем использовании и/или хранении. Подобный подход обеспечивает приготовление любых сред, используемых в клеточной биологии. В зависимости от объема сред время на их приготовление составляет от 15-ти минут для приготовления 1-го литра до 60-ти минут для приготовления 10-ти литров. Для приготовления большего объема сред (более 10 литров) используют фильтры большего диаметра (90 мм), позволяющие увеличить производительность стерилизующей фильтрации до 1 литра в минуту.

Предлагаемый способ подразумевает использование любых УЗ-ванн как с заданными производителем характеристиками, обеспечивающими кавитационные условия, так и устанавливаемыми вручную. В последнем случае единственным условием является возможность установки параметров частоты и амплитуды, обеспечивающих наступление состояния резонанса и, как следствие, возникновение кавитационных процессов, не сопровождающихся чрезмерным нагреванием и выплескиванием жидкости из ванны.

Отдельно следует отметить, что используемые компоненты среды являются низкомолекулярными соединениями, солюбилизация которых в водных растворителях не оказывает значимого влияния на вязкость среды, что могло бы динамично влиять в свою очередь на параметры распространения звуковых волн в озвучиваемых растворах.

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изготовление 1-го литра жидкой стерильной питательной среды α-МЕМ для культивирования мезенхимальных стволовых клеток.

Содержимое контейнера с сухой смесью компонентов среды α-МЕМ помещают в УЗ-ванну Elmasonic S 40/(Н) производства компании Elma (Германия) с 1 литром очищенной воды при температуре 20°С. Время озвучивания составляет 5 минут. Частота озвучивания постоянна и составляет 37 кГц, что задается встроенным генератором ванны. Наступление резонансного состояния, приводящее к появлению кавитации, обусловлено конструктивным решением ванны, позволяющим установить амплитуду колебаний уз/волн в диапазоне от 5 до 20 микрон. При этом амплитуда колебаний задается в режиме модуляции, исходя из допустимых объемов, а именно: от 0,5 до 5 литров озвучиваемой жидкости, не приводящая к выплескиванию раствора из ванны. Готовый раствор фильтруют в стеклянную стерильную емкость через каскад из трех стерильных фильтров диаметром 47 мм и размерами пор: 0,45-0,22-0,1 мкм соответственно, установленных в стерильные фильтродержатели, с эффективностью фильтрации 100 мл/мин. Полученный раствор переносят в ламинарный бокс, добавляют стерильную фетальную сыворотку (ФС) крупного рогатого скота (КРС) до конечной концентрации 15%. Полученную среду используют для разведения, промывки и культивирования перевиваемых мезенхимальных клеток на чашках Петри, во флаконах, биореакторах и т.д.

Пример 2. Изготовление 5-ти литров жидкой стерильной питательной среды α-МЕМ для криохранения мезенхимальных стволовых клеток.

Содержимое 5-ти контейнеров с сухой смесью компонентов среды α-МЕМ помещают в УЗ-ванну Elmasonic S 40/(Н) производства компании Elma (Германия) с 5-тью литрами очищенной воды при температуре 20°С. Время озвучивания составляет 8 минут. Частота озвучивания задается параметрами встроенного генератора и составляет 37 кГц. Амплитуда колебаний устанавливается в диапазоне от 5 до 20 микрон, что обеспечивает возникновение кавитационных процессов за счет наступления резонансного состояния в озвучиваемой жидкости. Готовый раствор фильтруют в стеклянную стерильную емкость через каскад из трех стерильных фильтров диаметром 47 мм и размерами пор: 0,45 - 0,22 - 0,1 мкм соответственно с эффективностью фильтрации 100 мл/мин. Полученный раствор переносят в ламинарный бокс, добавляют стерильную ФС крупного рогатого скота до конечной концентрации 20% и ДМСО до конечной концентрации 10%. Полученную среду используют для промывки и замораживания мезенхимальных клеток в криопробирках до температуры жидкого азота.

Пример 3. Изготовление 10-ти литров жидкой стерильной питательной среды α-МЕМ для комплекса работ с мезенхимальными стволовыми клетками из жировой ткани.

Содержимое 10-ти контейнеров с сухой смесью компонентов среды α-МЕМ помещают в УЗ-ванну Elmasonic S 40/(Н) производства компании Elma (Германия) с 10-тью литрами очищенной воды при температуре 20°С. Время озвучивания составляет 10 минут. Частота озвучивания задается параметрами встроенного генератора и составляет 37 кГц. Амплитуда колебаний устанавливается в диапазоне от 5 до 20 микрон, что обеспечивает возникновение кавитационных процессов за счет наступления резонансного состояния в озвучиваемой жидкости. Готовый раствор фильтруют в стеклянную стерильную емкость через каскад из трех стерильных фильтров диаметров 90 мм и размерами пор: 0,45-0,22-0,1 мкм соответственно с эффективностью фильтрации 1000 мл/мин. Полученный раствор переносят в ламинарный бокс, добавляют стерильную ФС крупного рогатого скота до конечной концентрации 15%. Полученную среду используют для выделения, фракционирования, промывки и культивирования мезенхимальных клеток, получаемых из жировой ткани.

Контейнеры с сухими смесями хранят при температуре +4°С. Срок хранения 5 лет (время наблюдения) не влияет на качество получаемой жидкой среды.

Оценку пригодности описанного способа получения сред для культивирования клеток млекопитающих проводят в условиях прямой симуляции технологического процесса. Для этого полученную среду в стерильных условиях разливают в чашки Петри, вносят клетки из расчета 100 тыс. на 1 мл среды и инкубируют в СО₂-инкубаторе при температуре 36°С и концентрации СО₂ - 5%. Среду считают пригодной, если на вторые сутки инкубации наблюдают устойчивую адгезию клеток на поверхности чашки, а после 3 пассажа число клеток увеличивается не менее чем в два раза (подсчет в камере Горяева).

Таким образом, предложенный способ изготовления жидких стерильных питательных сред позволяет обеспечить оперативное получение среды с надлежащими функциональными свойствами, а также существенно снизить риски и затраты, связанные с зависимостью качества готовых сред от условий хранения и транспортировки.

Технический результат от использования изобретения заключается в возможности получения любых сред для клеточной биологии в требуемых объемах в условиях обычной лаборатории и непосредственно перед началом планируемых работ, значительном повышении надежности и качества работ с клетками млекопитающих за счет отсутствия необходимости хранить готовые жидкие среды.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», так как все применяемые реагенты и оборудование доступны, а технологические приемы легко выполняемы.

Источники информации

1. Авторское свидетельство СССР №1025722, "Питательная среда для выращивания культур клеток животных", C12N 1/00, БИ 24, 1983.

2. Голубев Д.Б., Сомина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - М.: Медицина, 1976 г., с. 25.

3. Патент на изобретение №2161649, «Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата». C12N 5/00, 2001.

4. Авторское свидетельство СССР №1735360, "Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих", БИ 19, 1992.

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ изготовления жидких стерильных питательных сред. Способ включает растворение сухих компонентов питательных сред в оптимальных объемах растворителя и стерилизации получаемых растворов. Растворение проводят в течение 5-10 минут в ультразвуковой ванне при частоте генератора 37 кГц и амплитуде колебаний в диапазоне от 5 до 20 микрон. Стерилизующую ультрафильтрацию осуществляют с использованием каскада из трех последовательно расположенных мембранных фильтров с размером пор 0,45-0,22-0,1 мкм и эффективностью фильтрации от 100 до 1000 мл/мин. Изобретение обеспечивает получение питательных сред для клеточной биологии в требуемых объёмах непосредственно перед началом планируемых работ, а также повышение надёжности и качества работ с клетками млекопитающих. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Способ изготовления жидких стерильных питательных сред в требуемых количествах, пригодных для культивирования и хранения клеток млекопитающих, заключающийся в операции растворения сухих компонентов питательных сред в оптимальных объемах растворителя и стерилизации получаемых растворов, отличающийся тем, что растворение проводят в ультразвуковой ванне при частоте генератора 37 кГц и амплитуде колебаний в диапазоне от 5 до 20 микрон, обеспечивающей наступление состояние резонанса, приводящее к образованию кавитационных явлений, в течение 5-10 минут с последующей стерилизующей ультрафильтрацией с использованием каскада из трех последовательно расположенных мембранных фильтров с размером пор 0,45-0,22-0,1 мкм соответственно и эффективностью фильтрации от 100 до 1000 мл/мин непосредственно перед применением в качестве культуральной среды.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мембранные фильтры имеют диаметр 47 мм.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мембранные фильтры имеют диаметр 90 мм.