СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АКСЕНИЧЕСКИХ КУЛЬТУР МИКРОВОДОРОСЛЕЙ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/12 C12N1/02 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выделения аксенических культур микроводорослей при проведении физиолого-биохимического, цитологического и генетического изучения микроскопических водорослей.

Под аксеничностью понимают присутствие в культуре единственного вида водорослей, свободного от прочих микроорганизмов. Использование чистых, аксенических, культур - необходимая предпосылка успешного физиолого-биохимического изучения микроскопических водорослей. Однако, как известно, в альгологии именно этот этап является наиболее сложным. Собранный в природе живой материал представляет собой смесь различных видов водорослей, к тому же загрязненых бактериальной микрофлорой, которые, обладая антагонизмом в отношении друг друга, могут искажать результаты изучения лизоцим-антилизоцимных взаимодействий. Разделение альгологической и бактериальной составляющих весьма трудоемкий процесс. Между водорослями и бактериями существуют плотные биоценотические связи. Слизистые "обертки" водорослей служат источником питания и укрытиями для микроорганизмов, что позволяет считать их идеальным местообитанием бактерий [1]. Водоросли, в свою очередь, используют бактерии как источник витаминов B₂, B₆, B₁₂ [2]. Тесная мутуалистическая связь определяет трудность разделения альгобактериальных сообществ на изолированные культуры: водорослей и бактерий.

Известен способ выделения аксенических культур микроводорослей путем применения ультрафиолетового облучения [3, 4]. Однако недостатком данного способа является то, что ультрафиолетовое облучение оказывает мутагенное действие и может вызвать необратимые генетические изменения изучаемой культуры.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ выделения аксенических культур микроводорослей методом агаровых пластинок [5]. Способ заключается в том, что микроводорослевую суспензию, средняя плотность которой составляет 1 клетка/1 мм³, вносят в объеме 0,1 мл в чашку Петри и равномерно распределяют микробиологической петлей по поверхности 0,5-2%-го мясопептонного агара (МПА) с последующей инкубацией в термостате. Затем отдельные микроколонии, выросшие на поверхности мясопептонного агара, снимают стерильными инструментами вместе с кусочками плотной питательной среды и вносят в пробирки с соответствующими стерильными элективными жидкими питательными средами для накопления биомассы водорослей. Аксенические культуры водорослей получают с помощью многократного повторного рассева по поверхности МПА в стерильных условиях.

Однако известный способ имеет ограниченный круг применения. Например, при выделении аксенических культур сине-зеленых водорослей не удается добиться их полной свободы от бактерий, т.к. последние очень прочно связаны со слизистыми обертками этих микроводорослей. Процесс разделения их трудоемок, длителен и порой неэффективен, т.к. требует многократного пересева. Кроме того, при использовании петли получить отдельно лежащие клетки не удается, т.к. при значительной концентрации водорослевой суспензии петля не позволяет равномерно распределить водоросли по поверхности плотной питательной среды, к тому же при ее использовании часто происходит травмирование клеточных структур микроводорослей.

Заявляемый способ решает задачу повышения эффективности выделения аксенических микроводорослей и сокращение срока их выделения.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе выделения аксенических культур микроводорослей путем рассева микроводорослевой суспензии по поверхности плотной питательной среды, инкубации и последующего пересева выросших единичных микроколоний с кусочками плотной питательной среды в стерильные элективные жидкие питательные среды рассев микроводорослевой суспензии осуществляют путем ее втирания стеклянным шпателем в поверхность 1,5%-ной агаризованной питательной среды Прата, в которую предварительно вводят водный раствор мертиолата так, чтобы его концентрация в питательной среде составила 2 · 10^-6 г/мл.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что разработанный способ выделения аксенических культур микроводорослей имеет широкий круг применения, т.к. позволяет получать аксенические культуры микроводорослей независимо от источника выделения и степени их бактериальной обсемененности. Также использование предлагаемого способа позволяет сократить сроки выделения чистых культур микроводорослей, повысить эффективность их выделения и надежность получения искомых видов чистых культур микроводорослей.

Разработка заявляемого способа стала возможна после определения ряда моментов:
Использование чистых аксенических культур - необходимая предпосылка успешного физиолого-биохимического изучения микроводорослей.

1. В предлагаемом способе в качестве основы для 1,5% плотной питательной среды используется среда Прата: KNO₃ - 0,10 г/л, K₂HPO₄ - 0,01 г/л, MgSO₄ · 7H₂O - 0,01 г/л, FeCl₃ · 6H₂O - 0,001 г/л. Она является универсальной для всех видов водорослей и позволяет сохранять разделяемые альгокультуры физиологически активными.

2. Для разделения альгокультур рекомендуется использовать стеклянный шпатель и рассев приемом по Дригальскому (путем втирания в поверхность питательной среды), в этом случае методика рассева и использование стеклянного шпателя позволяют разбить смесь водорослей на единичные клетки, что сохраняет их целостность, а следовательно, значительно облегчает и ускоряет процесс выделения чистых культур.

3. Мертиолат (Thimerosal) - натриевая соль этилмеркурисалициловой кислоты, кристаллический порошок желтого цвета, растворимый в воде [6], применяется как консервант белковых растворов [7, 8]. В иммунологических лабораторных исследованиях растворы мертиолата широко применяется для предупреждения контаминации клеток животных и человека бактериофлорой.

Авторами экспериментально установлено, что присутствие в агаризованной питательной среде Прата мертиолата в концентрации 2 · 10^-6 г/мл способствует освобождению клеток микроводорослей от сопутствующей им бактериофлоры.

Были приготовлены плотные питательные среды. Предварительно готовили водный раствор мертиолата с концентрацией вещества 2 · 10^-3 г/мл. В расплавленную агаризованную питательную среду Прата пипеткой вносили приготовленный раствор мертиолата так, чтобы его концентрация в питательной среде составила: 2 · 10^-8; 2 · 10^-7; 2 · 10^-6; 2 · 10^-5; 2 · 10^-4 г/мл. Затем приготовленные питательные среды разливали по 10 мл в чашки Петри и оставляли при комнатной температуре для застывания.

Далее в чашки вносили по 0,1 мл концентрированной водорослевой суспензии и путем втирания стеклянным шпателем равномерно распределяли по поверхности питательной среды. После суточной инкубации в термостате при + 25^oC с целью бактериологического контроля производили пересев исследуемых альгокультур на мясопептонный агар. Результаты исследований представлены в таблице.

Как видно из данных, представленных в таблице, содержание в агаризованой среде Прата мертиолота в концентрациях, меньших 2 · 10^-6 г/мл (среды 1, 2), не освобождает клетки микроводорослей от сопутствующей им бактериофлоры. В тоже время при содержании мертиолата в питательной среде в дозах, превышающих 2 · 10^-6 г/мл (среды 4, 5), начинается подавление роста всех изучаемых культур. Из этого следует, что эффект, связанный с освобождением микроводорослей от сопутствующей микрофлоры с сохранением жизнедеятельности изучаемых микроводорослевых клеток, достигается созданием в агаризованной среде Прата концентрации мертиолата 2 · 10^-6 г/мл.

4. В работе при выделении чистых альгокультур была использована питательная среда, приготовленная на основе универсальной среды Прата: KNO₃ - 0,10 г/л, K₂HPO₄ - 0,01 г/л, MgSO₄ · 7 H₂O - 0,01 г/л, FeCl₃ · 6H₂O - 0,001 г/л, агар-агар - 1,2 - 1,5%, которую используют в альгологии для хранения и культивирования водорослевых культур. Использование данной агаризованной среды позволило обеспечить альгокультурам необходимые условия для роста.

Способ осуществляется следующим образом.

Собранный в природе живой материал объемом 500-100 мл концентрируют с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 3-5 минут до объема 1-2 мл. Полученный осадок, содержащий альгобактериальные культуры в объеме 0,1 мл, вносят в чашку Петри и втирают стеклянным шпателем в поверхность 1,5%-ной агаризованной среды Прата, в которую предварительно введен водный раствор мертиолата так, чтобы его концентрация в ней составляла 2 · 10^-6 г/мл. Чашки с посевом помещают в термостат и инкубируют при температуре + 25^oC в течение 24 часов для достижения подавляющего действия мертиолата на бактерии. Затем под микроскопом единичные микроколонии снимают с кусочками плотной питательной среды и помещают в соответствующие стерильные элективные жидкие питательные среды для накопления биомассы исследуемых микроводорослей.

Приводим примеры конкретного выполнения заявляемого способа.

Пример 1. Из воды реки Урал для научных целей необходимо было выделить культуру водорослей Scenedesmus guadricauda. С этой целью из природной воды (объемом 0,5 литра) путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 3-5 мин была приготовлена водорослевая суспензия (объемом 1-2 мл), которая состояла из нескольких видов водорослей при бактериальной обсемененности 10⁵ КОЕ/мл. Полученную суспензию, содержащую альгобактериальную ассоциацию, в объеме 0,1 мл внесли в чашку Петри и стеклянным шпателем равномерно растерли по поверхности агаризованной среды Прата, содержащую мертиолат в дозе 2 · 10^-6 г/мл. После суточной инкубации чашек при +25^oC микроколонии водорослей стерильным инструментом сняли вместе с кусочками плотной питательной среды и поместили в стерильную элективную жидкую среду Тамия [5] для накопления биомассы полученных водорослей.

С помощью предлагаемого способа в результате одного пассажа удалось получить аксеничную культуру Scenedesmus guadricauda, содержащую один вид водоросли, свободный от сопутствующей бактериофлоры (на фиг. 1 - рост микроводорослей на плотной питательной среде, содержащей мертиолат в дозе 2 · 10^-6 г/мл, ув. х20).

В результате использования способа-прототипа из суспензии в течение 2-х пассажей была получена культура, содержащая преимущественно вид Scenedesmus guadricauda. Однако кроме указанного вида в культуральной среде регистрировались единичные клетки микроводорослей Oocystis lacustris, Scenedesmus acuminatus и бактерии в количестве 10¹ КОЕ/мл. В результате повторных посевов удалось выделить Scenedesmus guadricauda в монокультуру, но избавиться от сопутствующих им бактерий так и не удалось (на фиг. 2 - рост микроводорослей на плотной питательной среде без добавления мертиолата).

Пример 2. Из воды реки Карагалки для научных целей необходимо было выделить культуру водорослей Microcystis aeruginosa. Полученная аналогично первому примеру микроводорослевая суспензия состояла из нескольких видов водорослей при бактериальной обсемененности 10⁸ КОЕ/мл. Как и в первом случае, ее внесли в чашку Петри и стеклянным шпателем равномерно растерли по поверхности агаризованной среды Прата, содержащую мертиолат в дозе 2 · 10^-6 г/мл. После суточной инкубации чашек при +25^oC микроколонии водорослей стерильным инструментом сняли вместе с кусочками плотной питательной среды и поместили в стерильную элективную жидкую среду Чу [5] для накопления биомассы полученных водорослей.

С помощью предлагаемого способа в результате одного пассажа удалось получить аксеничную культуру Microcystis aeruginosa, содержащую один вид водоросли, свободный от сопутствующей бактериофлоры.

В результате использования способа-прототипа из суспензии в течение 3-х пассажей была получена культура, содержащая преимущественно вид Microcystis aeruginosa. Однако кроме указанного вида в культуральной среде регистрировались единичные клетки микроводорослей Coelastrum pseudomicroporum, Coenacystis corschikoffii и бактерии в количестве 10³ КОЕ/мл. В результате повторных посевов микроводоросли вида Microcystis aeruginosa удалось выделить в монокультуру, но избавиться от сопутствующих им бактерий так и не удалось.

Таким образом, использование заявляемого способа выделения аксенических культур микроводорослей позволяет сократить сроки выделения чистых культур, повысить эффективность их выделения и надежность получения искомых видов чистых культур микроводорослей. Также способ имеет широкий круг применения, т. к. позволяет получать аксенические культуры микроводорослей независимо от источника выделения и степени их бактериальной обсемененности.

Источники информации
1. Stewart W.D.P. Algae, men and environment, Syracuse - N.Y. - 1968. - 302 p.

2. Юнг Л. А., Панкратова Е.М. //Труды Кировского сельскохозяйственного института, 1967. - N 20. - Вып.40. - 98 с.

3. Gerloff G.C., Fitzgerald G.P., Skoog F. // The isolation purification and culture of blue-green Amer. J., 1950. - Vol. 37. -N 3. - P. 216.

4. Квитко К.В. Получение культур отдельных клеток хлореллы // Исследования по генетике. - Л.: Из-во Ленинградского университета, 1961. - Вып. 1. - С. 50-54.

5. Вассер С.П., Кондратьева Н.В., Масюк Н.П. и др. Водоросли. Справочник. - Киев: Наукова думка, 1989. - 608 с. (прототип).

6. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. Биргера М.О. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.

7. Газизова Г.P. Исследование токсичности консервантов в бактерийных и сывороточных препаратах на клеточной культуре //Препараты крови. - Горький, 1981. - С. 55-58.

8. Волгарева Г.М. Цитогенетический контроль безвредности мертиолата // ЖМЭИ, 1989. - N 11. - С. 46-52.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выделения аксенических культур микроводорослей при проведении физиолого-биохимического, цитологического и генетического изучения микроскопических водорослей. Способ выделения аксенических культур микроводорослей осуществляют путем рассева микроводорослевой суспензии по поверхности плотной питательной среды, суточной инкубации и последующего пересева выросших единичных микроколоний с кусочками плотной питательной среды в стерильные элективные жидкие питательные среды. Рассев микроводорослей суспензии осуществляют путем ее втирания стеклянным шпателем в поверхность 1,5%-ной агаризованной питательной среды Прата, в которую предварительно вводят водный раствор мертиолата так, чтобы его концентрация в питательной среде составила 2·10^-6 г/мл. Способ позволяет сократить сроки выделения чистых культур, повысить эффективность их выделения и надежность получения искомых видов чистых культур микроводорослей. Также способ имеет широкий круг применения, т.к. позволяет получать аксенические культуры микроводорослей независимо от источника выделения и степени их бактериальной обсемененности. 1 табл., 2 ил.

Способ выделения аксенических культур микроводорослей путем рассева микроводорослевой суспензии по поверхности плотной питательной среды, инкубации и последующего пересева выросших единичных микроколоний с кусочками плотной питательной среды в стерильные элективные жидкие питательные среды, отличающийся тем, что рассев микроводорослевой суспензии осуществляют путем ее втирания стеклянным шпателем в поверхность 1,5%-ной агаризованной питательной среды Прата, в которую предварительно вводят водный раствор мертиолата так, чтобы его концентрация в питательной среде составила 2 · 10^-6 г/мл.