Способ определения пестицидов и лекарственных веществ антихолинэстеразного действия Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/46 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к химико-токсикологическому и клиническому анализу и контролю объектов окружающей среды.

Известен способ определения пестицидов антихолинэстеразного действия, использующий фермент в виде нормальной сыворотки крови лошади. и включающий смешение фермента, анализируемой пробы и субстрата и оценку степени угнетения активности фермента по скорости изменения окраски по сравнению с контролем. Этот метод используется для определения микроколичеств дихлофоса, диброма, циодри- на, а после концентрирования экстрактов - хлорофоса и амидофоса.

Недостатками метода являются невысокая чувствительность, узкий круг определяемых веществ и сложность проведения анализа.

Известен способ, использующий фермент в виде промышленных препаратов. По данному способу в ячейку вводят раствор препарата фермента, анализируемую пробу (экстракт из патматериала), раствор субстрата (ацетилхолин) и бромтимоловый синий (индикатор). Степень угнетения активности фермента устанавливают по изменению окраски индикатора от синей до синевато-желтой.

Недостатками прототипа являются недостаточно высокая чувствительность, ограVI

4 СЛ VI О

О

ниченные технологические возможности и сложность проведения анализа.

Целью изобретения является повышение чувствительности, расширение технологических возможностей и упрощение анализа.

Поставленная цель достигается тем, что фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммониевой соли N- фталилхитозана, и перед смешением к ферменту добавляют воду или буферный раствор до концентрации М-фталилхитоза- на 0,02-0.1 мас.%.

П р и м е р 1. Готовят 0,2%-ный водный раствор натриевой соли М-фталилхитозана. К10 мл раствора полимера добавляют 76 мг промышленного препарата бутирилхолинэ- стерезы из сыворотки крови лошади (КФ 3.1.1.8) с активностью 6Е/мг (общая активность 456 Е). Полученный раствор разливают в ячейки планшета по 0,02 мл, высушивают на воздухе и получают в них дозированные количества твердого раствора фермента в полимере. Перед определением параоксона в 10 ячеек с твердым раствором вносят по 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 8;0), растворяют в течение 1 мин (получают 0,04 %-ный раствор полимера), последовательно в каждые 2 ячейки добавляют по 0,02 мл водного раствора параоксона в концентрациях 0; 1 моль/л, фиксируя время внесения ингибитора. Точно через 2 мин инкубации ингибитора с ферментом в ячейки добавляют по 0,08 мл 8-10 4 моль/л раствора индофенилацетата в 8 об.%-ном этаноле. Измеряют время изменения окраски от желтого до зеленого цвета. Весь анализ проводят при комнатной температуре.

Результаты определения представлены в таблице.

П р и м е р 2. Проводят определение параоксона аналогично примеру 1 в концентрациях 0; моль/л, увеличив время инкубации ингибитора с ферментом до 10 мин.

П р и м е р 3. Проводят определение параоксона аналогично примеру 1, получая после растворения твердого раствора 0,02- 0,2%-ные растворы аммониевой соли N- фталилхитозана.

Пример 4. В условиях примера 1, используя 0,1%-ные растворы полимера и не проводя инкубацию фермента1 с ингибитором, определяют атропин, метацин, N-ме- тил-4-пиперидинилбензилат и скопаламин. взятые в концентрациях 1 1 5х хЮ ; 1 -10 соответственно.

П р и м е р 5. Проводят определение диизопропилфторфосфата аналогично примеру 1.

П р и м е р 6. Проводят определение

хлорофоса в концентрациях 0; 1 10 ; 1 -10 аналогично примеру 1.

П р и м е р 7. Проводят определение хлорофоса аналогично примеру 1. Растворы предварительно активируют при 70°С и рН9,0 в течение 0,5 ч.

Примерз. Проводят определение ДДВФ аналогично примеру 1.

Пример 9. Юг тщательно измельченного мяса помещают в склянку с притертой

пробкой и заливают 10 мл хлороформа, содержащего параоксон в концентрации 1х хЮ моль/л, и экстрагируют в течение 1 ч. Затем фильтруют через вату, отбирают 1 мл экстракта и высушивают на воздухе. Сухой

остаток растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Определение параоксона в полученном растворе проводят аналогично примеру 1. Хлороформ в контрольной пробе не содержит параоксона.

П р и м е р 10. Готовят 0,1 %-ный водный раствор натриевой соли М-фталилхитозана. К 10 мл раствора добавляют 100 Е промышленного препарата ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека (КФ 3.1.1.7) и

1,5 мг бромтимолового синего. Полученный раствор разливают в ячейки планшета по 0,02 мл, высушивают на воздухе и получают в них дозированные количества твердого раствора фермента в полимере. Передопределением армина в ячейки вносят по 0,1 мл 0.01 моль/л фосфатного буфера (рН « 7,5), растворяют в течение 1 мин (получают 0,02 %-ный раствор полимера), последовательно в каждые две ячейки добавляют по

0,02 мл водного раствора армина в концентрациях 0; l-. 1- 10 7; 1 -10 6 и 1-Ю 5 моль/л, фиксируя время внесения ингибитора. Точно через 5 мин инкубации фермента с ингибитором в ячейки добавляют по

0,08 мл 2, моль/л ацетилхолинхлори- да. Измеряют время изменения окраски от синей до зеленовато-желтой. Одновременно определение армина проводят по известному и предлагаемому способам с

иммобилизованной в желатине ацетилхоли- нзстеразой.

Пример 11. Проводят определение параоксона аналогично примеру 1. Используют твердые растворы бути рил холи нэсте5 разы в аммониевой соли N-фталилхитозана, приготовленные непосредственно перед определением, за 1 и 3,5 года до него.

Предлагаемый способ позволяет быстро и легко проводить определение широкого круга соединений, обладающих антихо- линэстерэзной активностью, обеспечивает низкий предел обнаружения ингибиторов, имеет широкие технологические возможности (например, проведение анализа в массовом порядке в полевых условиях).

Формула изобретения Способ определения пестицидов и лекарственных веществ антихолинэстеразно- го действия, включающий смешение фермента, анализируемой пробы и субстра0

та и оценку степени угнетения активности фермента по скорости изменения окраски в сравнении с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, расширения технологических возможностей и упрощения анализа, фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммониевой соли N-фталилхи- тозана и перед смешением к ферменту добавляют воду или буферный раствор до концентрации М-фталилхитозана 0,02-0,1 мас.%.

Использование: аналитическая химия, химико-токсикологический анализ, контроль объектов окружающей среды. Сущ- ность изобретения: фермент, обладающий холинзстеразной активностью, смешивают с субстратной хромогенной смесью и анализируемой пробой, определяют степень угнетения активности фермента по скорости изменения окраски в сравнении с контролем и содержание анализируемых веществ о пробе по степени угнетения активности Фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммониевой соли N- фталилхитозана, к которому перед смешиванием добавляют воду или буферный раствор до содержания М-фталилхито- зана 0,02-0,1 мае. %. 1 табл.

1

2 1)

1 IS

1

0k

04

Ларэоксон

Ы0 е I-10- 1-10Ы0 тI 10- I-10 5

.,г;

о

110-

1-10- МО

:.,.-

ыо-

о но1 I0 s

о

1-Ю

ые- МО

Атропин

Мвтвцин

Н-Иетил-4пмпермдимил-бемэияат

Скопалаиин1.10

Дииэо.пропилфтор- О

ос атI-IO-

1 10-

-с-сесс2

ч 1

«.Ob

0.04 0,02

,lfl-

о

I.10-

ыо- 1 .ir;

1И(ГТ

ыо-

0

ыо- ью-7 ыо-« .tff

1-10-«

10

10

10

10

Ю-

10

13

5

5

Время инкубации увеличено до Ю

Окраска меняете от желтого цвета до розового

ю-

ю

ю10

1010

ю-6 ю-ь

)0-

ю-

Ингибитор экстрагировали из мнса

ю-г

Известный способ

1,5 и Фермент иммобилизо (включая ван мелатине время набукамин)

0,04 I Лараоксон

ЫО

О 1-10

О 1-10

г

,-

г«

10

1010

Сразу после приготовления твердого раствора

Черва I год после приготовления

Черв 3,5 года после приготовления