РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PVAX2 ДЛЯ ПЕРЕНОСА И ЭКСПРЕССИИ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ГЕНА ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В И ШТАММ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В Советский патент 1995 года по МПК C12N15/51 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности генетической инженерии и медицине, конкретно к медицинской вирусологии и представляет собой рекомбинантный штамм вируса осповакцины, полученный с помощью методов генетической инженерии и предназначенный для приготовления живой вакцины против гепатита В.

Целью изобретения является получение рекомбинантного вируса осповакцины, индуцирующего поверхностный антиген вируса гепатита В и пригодного для вакцинации людей.

С помощью плазмиды pVAX2, состоящей из вектора pVAR15 и гена поверхностного антигена вируса гепатита В (S_гена), последний переносится в геном вируса осповакцины - вариант штамма Листер-ЛИВП, обладающий низкой нейровирулентностью для кроликов и мышей и широко апробированный на людях (от привит более чем 1,5 млрд. человек). Полученный рекомбинант ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- индуцирует НВ Ag в зараженных клетках и обладает tk^-фенотипом. Для восстановления tk⁺ фенотипа в HindIIIF фрагмент генома рекомбината ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- введен тимидинкиназный ген вируса простого герпеса I и получен рекомбинат ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺.

Вектор pVAR15 для переноса генов в геном вируса осповакцины и их экспрессии размером 4,5 т.п.о. состоит из следующих элементов: HindIII-PvuII фрагмент плазмиды pBR322 ΔRI несущий ген ампициллин-устойчивости и репликон (2,3 т. п.о.), HindIII - HindII фрагмент генома ВОВ, несущий ген тимидинкиназы (1,9 т.п.о.); EcoRI-HindII фрагмент плазмиды pAV 18, несущий промотор гена 7,5 К белка ВОВ (0,3 т.п.о.).

Вектор PVAR15 несет по одному участку узнавания рестрикционными эндонуклеазами FBamHI, SmaI, EcoRI на расстоянии 36, 41, 46 п.о. от точки инициации транскрипции соответственно.

Плазмида pVAX2 размером 5,8 т. п.о. состоит из следующих элементов: вектора pVAR15 (4,5 т. п.о.) и XhoI-BamHI и фрагмента плазмиды pHBV 320, содержащего ген поверхностного антигена вируса гепатита В (1,2 т.п.о.). Плазмида pHBV 320 получена в Институте органического синтеза АН ЛатССР и несет полный геном вируса гепатита в субтипа ayW. Расстояние между точками инициации транскрипции и точной инициации трансляции равно 67 п.о.

Рекомбинат вируса основакцины ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- содержит ген вируса гепатита В, поставленный под контроль промотора гена 7,5 К белка ВОВ и вставленный в тимидинкиназный ген вируса осповакцины, в соответствии со структурой плазмиды pVAX2, использованный для получения вируса осповакцины, индуцирующего HBwsAg.

Рекомбинат ЛИОГЕН-НВ/С2-К⁺ отличается от описанного рекомбината тем, что в HidIIIF фрагмент генома дополнительно вставлен ген тимидинкиназы вируса простого герпеса 1/BgIII-BamHI фрагмент длинной 2,75 т.п.о. (из плазмиды рМ2).

Морфология, признаки штамма.

Рекомбинанты ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- и ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺ по морфологии являются типичными ортопоксвирусами, не отличающимися от исходного штамма ЛИВП. Вирионы имеют брикетообразную форму длиной около 300 нм и шириной около 200 нм. В ультратонких срезах видно, что зрелый вирион имеет двуконтурную наружную оболочку, восьмеркообразный нулеоид и два боковых тела. В ультратонких срезах зараженных клеток видны также характерные незрелые формы вирионов с незавершенной наружной оболочкой или же без дифференцированного нулеоида и боковых тел.

Физиолого-биохимическая характеристика и культуральные свойства штамма.

Оба рекомбината содержат ДНК длиной около 180 кб. При рестрикционном анализе ДНК имеет профиль, характерный для вируса осповакцины, но имеются и четкие отличия от ДНК исходного штамма ЛИВП, отсутствует характерный HindIIIK фрагмент, в который произведена встройка S гена ВГВ/К-фрагмент ЛИВП содержит tk^--ген вируса осповакцины и идентичен J-фрагменту штамма WR. Рекомбинат ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- не индуцирует образования тимидинкиназы и обладает tk^- фенотипом. Рекомбинат ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺ индуцирует тимидинкиназу вируса герпеса и обладает tk- фенотипом.

В отличие от исходного штамма ЛИВП рекомбинанты индуцируют HBsAg в количестве 250-500 нг/10⁶ клеток или 30-60 нг/10⁶ ВОЕ. При электрофорезе в полиакриламидном геле профиль белков рекомбинантных вирусов не отличается от профиля белков исходного штамма ЛИВП (в вирионах выявляется около 50 белков).

Рекомбинанты не отличаются от исходного штамма ЛИВП по способности размножаться и вызывать характерные изменения в культуре клеток обезьяны (линия CV-1), человека (линия 143 tk^-), крысы (линия Rat2tk^-), куриного эмбриона, на хориоаллантоисной оболочке куриных эмбрионов.

ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺ образует более крупные бляшки в культуре клеток CV-1 и куриных эмбрионов по сравнению с ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^-, что указывает на лучшую репродуктивную активность первого.

Антигенные и серологические свойства.

Штаммы ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- и ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺ не отличаются в реакции нейтрализации от вируса осповакцины. При накожном и внутрикожном заражении рекомбинанты, так же как и исходный штамм, ЛИВП вызывает у кроликов образование нейтрализующих антител к вирусу осповакцины. В отличие от исходного штамма ЛИВП, рекомбинанты вызывают у кролика образование высокого титра антител к HBsAg (10000-20000 ед. RIA/мл сыворотки).

Патогенность для животных.

Штаммы ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- и ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺ вызывают типичные для вируса осповакцины поражения на коже кроликов.

Рекомбинанты обладают меньшей нейтровирулентностью, чем исходный штамм ЛИВП. Штамм ЛИВП в 3000 раз менее нейтровирулентен, чем штамм WR, на основе которого получены рекомбинанты в прототипе. Рекомбинанты в 1000000 раз менее нейровирулентны по сравнению со штаммом WR и в 100 раз по сравнению с ЛИВП. При иммунизации кроликов рекомбинанты вызывают у них образование антител к HBsAg. Штамм ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- и ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺ не пассировались в злокачественных клетках человека. Они прошли пассажи в перевиваемых нетрансформированных клетках крысы (линия Rat2tk^-) и обезьяны (CV-1), на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона, на коже кроликов и теленка и сохраняются в виде соскоба кожи теленка с титром порядка 10¹⁰ БОЕ/г соскоба.

Штаммы не отличаются от известных по уровню синтеза HBsAg в расчете на одну клетку, но превосходят более чем на порядок по выходу антигена в расчете на одну вирусную частицу, что может обеспечить более высокое соотношение антигепатитных антител к антиосповакцинным при вакцинации людей.

П р и м е р 1. 10 мкг ДНК плазмиды pVAR15 обрабатывают рестрикционной эндонуклеазой BamHI в стандартном буфере (50 мМ HCl рН 7,4; 50 мМ NaCl; 10 мМ MgCl₂) в объеме 100 мкл. После завершения расщепления обрабатывают 50 мкл фенола, нейтрализованного NaOH и забуферененного 1 М трис-HCl рН 8,0 и содержащего 20 мМ ЭДТА, 0,2% 2-меркаптоэтанола. Водную фазу отбирают в пробирку и добавляют 20 мкл 3 М NaCH₃-COOH и 0,6 объемов изопропанола, выдерживают 1 ч при -20^оС и центрифугируют 1200 g, 5 млн. Осадок растворяют в 20 мкл ТЕ (10 мМ трис-HCl рН 8,0; 1 мМ ЭДТА). Наносят на 1% гель легкоплавкой агарозы, приготовленный на трис-боратном буфере и проводят электрофорез при напряжении 3 В/см. ДНК визуализируют окраской бромистый этидием при освещении геля ультрафиолетовым излучением длиной 366 нм; полосу, содержащую линеаризованный вектор, вырезают скальпелем и выделяют ДНК методом замораживания - оттаивания. Элюированную из геля ДНК подвергают обработке бактериальной щелочной фосфатазой в стандартном буфере, обрабатывают три раза фенолом и осаждают изопропанолом, как описано. Осадок растворяют и осаждение повторяют еще два раза. Окончательно ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ. Смешивают дефосфорилированную ДНК с XhoI-BamHI фрагментом плазмиды pHBV 320 примерно в 1,5-кратном молярном избытке последнего и проводят лигирование в присутствии 1 мМ АТФ и 10 мМ дитиотреитола в стандартном буфере и объеме 20 мкл. Через 12 ч смесь разводят 10 раз ТЕ, обрабатывают фенолом и переосаждают 3 раза, как описано. Растворяют в 100 мкл ТЕ, добавляют десятикратный стандартный буфер (12 Мкл) дезоксинуклеотидтрифосфаты в концентрации 0,5 мМ каждый и 2 ед. кленовского фрагмента ДНК-полимеразы 1, инкубируют 1 ч при 20^оС, затем добавляют АТФ до 0,1 мМ, дитиотрентол до 5 мМ и проводят лигирование в присутствии 50 ед. лигазы при 4^оС 12 ч, полученной смесью трансформируют клетки E. coli, штамм НВ101 по известной схеме. Трансформанты высевают на агаризованную среду Лурия, содержащую ампициллин (25 мкг/мл). Выросшие клоны анализируют с помощью рестрикционных эндонуклеаз после выделения ДНК методом кипячения. Встройка XhoI-BamHI фрагмента в BamHI участок расщепления по использованной схеме приводит к восстановлению участка узнавания XhoI и выщеплению соответствующего фрагмента при расщепления рекомбинантных плазмид XhoI-BamHI, XhoI-EcoRI. Один из клонов, обозначенный как pVAX2, выбирают для последующей работы. ДНК плазмиды PVAX2 выделяют центрифугированием в CsCl.

П р и м е р 2. Монослой клеток почки зеленой мартышки (линия CV-I), выращенной в 50 мл флаконе, поверхностью 20 см² инфицируют клонированным вирусом осповакцины, штамм ЛИВП ТК⁺, накопленным в клетках CV-1. Множественность инфекции - 0,1 БОЕ/клетка. После 1,5 ч инкубации при 37^оС зараженные клетки трансформируют плазмидой pVAX2 с использованием кальцийфосфатного метода. Для приготовления трансфекционной смеси к 250 мл двукратного буфера HEPES 50 мМ; рН 6,8, NaCl 280 мМ, NaHPO₄ 1,5 мМ добавляют 5 мкг плазмиды pVAX2,2 мкг ДНК вируса осповакцины ЛИВП, 13 мкг ДНК спермы лосося, бидистиллированную воду до объема 475 мкл и 25 мкл 2,5 М раствора CaCl₂. Смесь оставляют на 30 мин при комнатной температуре для образования преципитата. Культуральную жидкость из флакона с зараженными клетками CV-1 удаляют и заменяют 0,5 мл трансфекционного коктейля. Клетки инкубируют при комнатной температуре 30 мин, после чего добавляют 4,5 мл среды DMEM с 20 мМ буфера HEPES рН 7,1 и инкубируют флакон 4 ч при 37^оС. Затем среду удаляют и заменяют 20%-ным раствором глицерина на среде МЕМ на 3-4 мин, после чего глицерин отмывают средой МЕМ, вносят во флакон 5 мл среды МЕМ с 3% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), инкубируют при 37^оС до полной специфической дегенерации клеток (48 ч), после чего подвергают культуру троекратному замораживанию - оттаиванию. Собранный из флакона вируссодержащий материал используется для селекции рекомбинантных частиц. Материалом заражают клетки крысы (линия Rat2tk^-), выращенные в двух чашках Петри диаметром 100 мм (около 100 БОЕ/см²). После адсорбции вируса (1 ч при 37оС в термостате с 5% СО₂) клеточный монослой покрывают 10 мл питательного агара, содержащего 25 мг/мл 5-бром-2'-дезоксиуридина (БДУ). Состав питательного агара (на 100 мл): агар Дифко 1 г, 10 Х концентрат среды МЕМ 10 мл, ЭБС 3 мл, 7,5%-ный раствор бикарбоната натрия 5 мл, 0,1%-ный раствор нейтральрота 3 мл, пенициллин и стрептомицин - по 10000 ед, бидистиллированная вода до 200 мл. Чашки инкубируют при 37^оС в атмосфере с 5% СО₂ в течение 4 дней и отмечают бляшки, образованные ТК- вирионами вируса осповакцины. Агар из области бляшек отсасывают в пробирки с 0,5 мл среды МЕМ и замораживают при -20^оС. Содержимым каждой пробирки заражают одну лунку с клетками Rat2tk-, выращенными в 24-луночной пластиковой панели (панель N 1) - 0,2 мл/лунка. Зараженные клетки инкубируют при 37^оС в атмосфере с 5% СО₂ в среде МЕМ (1 мл/лунка) с 3% ЭБС и 29 мг/мл БДУ в течение 4 дней, лунки с четкой специфической дегенерацией отмечают, панель с клетками подвергают траекторному замораживанию - оттаиванию. Материалом из отмеченных лунок заражают по одной лунке с клетками CV-1, выращенными в 24-луночной панели (панель N 2). Зараженные клетки инкубируют в среде МЕМ с 3% ЭБС при 37^оС и 5% СО₂до наступления полной специфической дегенерации клеток. Панель с клетками подвергают троекратному замораживанию - оттаиванию, отбирают из каждой лунки по 0,5 мл культурной жидкости и исследуют ее с помощью твердофазного метода на наличие поверхностного антигена вируса гепатита B/HBsAg/. Для выявления HBsAg используют набор Auszymell фирмы Abbott (США), исследование проводят по инструкции фирмы. Если в лунке панели N 2 выявляется HBsAg, соответствующая ей лунка в панели N 1 считается содержащей рекомбинантный вирус 7 клонов из 17 исследованных индуцируют HBsAg. Материал одной из лунок панели N 1 подвергают дополнительному клонированию. С этой целю клетки CV-I в чашках Петри инокулируют этим материалом, чтобы получить не более 50 бляшек на чашке. Клонируют 5 бляшек в клетках CV-I, как описано, и проверяют каждый клон на наличие HBsAg. Все 5 клонов содержат HBsAg. Один из клонов обозначен как ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- и размножен путем заражения клеток CV-I, выращенных в 1 л матрасе. Вируссодержащая культурная жидкость сохраняется при -20^оС и служит исходным материалом для дальнейшего использования рекомбината.

П р и м е р 3. Плазмиду pFR-ТК получают, как в примере 1. В плазмиду pBR322 Δ Bam вставляют EcoRI фрагмент 3,5 т.п.о. из HindIIIF фрагмента ВОВ, штамм WP и получают плазмиду pFR BgIII-BamHI фрагмент 2,75 т.п.о., содержащий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 из плазмиды рМ 2, вставляют в BamHI участок pFR, получая плазмиду pFR-ТК.

Клетки CV-I в чашке Петри (60 мм), зараженные рекомбинантом ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК^- с множественностью 0,1 БОЕ/клетка, через 1,5 ч после заражения трансфицированы плазмидой pFR-ТК. Состав трансфекционного коктейля: 2-кратный буфер HEBS. (см. пример 2) 250 мкл; плазмида pFR-ТК 5 мкг; ДНК спермы лосося 15 мкг; бидистиллированная вода до 475 мкл; 2,5 М CaCl₂ 25 мкл). Трансфекционный коктейль вносят непосредственно в поддерживающую среду (0,5 мл коктейля на 4,5 мл среды DMEM с буфером HEPES, 20 мМ рН 7,1) на 4 ч (инкубация 37^оС и 5% СО₂). Затем среда удаляется, клетки обрабатываются 20% -ным раствором глицерина и поддерживаются на среде МЕМ с 3% ЭБС до полной специфической дегенерации. Вирусный материал клонируют в клетках Rat2tk^-. Клетки, выращенные в чашках Петри (100 мм), заражают исследуемым материалом (10000 БОЕ/чашка) и инкубируют под питательным агаром, содержащем среду НАТ (гипоксантин 10 мкг/мл; аминоптерин 0,2 мкг/мл; тимидин 10 мкг/мл). Появившиеся через 72 ч бляшки, образованные ТК⁺ вирионами, клонируют в клетках Rat2tk^-, выращенных в 24-луночной панели (N 1); в качестве поддерживающей среды используют среду НАТ с 3% ЭБС. Через 72 ч содержимое всех лунок переносят в соответствующие лунки 24-луночной панели (N 2) с клетками Rat2tk^- и проводят пассаж материала на среде НАТ. Материал из одной лунки панели N 2 с четкой специфической дегенерацией подвергают повторному клонированию на клетках Rat2tk^-, используя питательный агар со средой НАТ и две последовательные панели (N 1 и 2) с клетками Rat2tk^-, как описано. Материал из 4 лунок, содержащих ТК⁺ вирус, переносят в лунки панели (N 3) с клетками CV-I и после поступления специфической дегенерации исследуют содержимое лунок на наличие HBsAg (см. пример 1). В данном примере все 4 исследованных ТК⁺ клона положительны по HBSAg. Один из клонов, обозначенный как ЛИОГЕН-НВ/С2-ТК⁺, размножен в клетках CV-I и служит исходным материалом для дальнейшего использования рекомбинанта.

Таким образом, получены штаммы вируса осповакцины, индуцирующие поверхностный антиген вируса гепатита В и пригодные для вакцинации людей. Положительный эффект достигается тем, что для приготовления рекомбинантов использовали штамм вируса осповакцины ЛИВП и новую плазмиду pVAX2, содержащую ген поверхностного антигена вируса гепатита В под контролем гена 7,5 К белка ВОВ, у которой в отличие от использованной в прототипе, расстояние между точкой инициации транскрипции и точкой инициации трансляции равно 67 п. о. вместо 162 п.о., что по-видимому, является причиной повышения уровня синтеза HBsAg в зараженных клетках в расчете на БОЕ.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности генетической инженерии и медицине, конкретно к медицинской вирусологии и представляет собой рекомбинатный штамм вируса осповакцины, полученный с помощью методов генетической инженерии и предназначенный для приготовления живой вакцины против гепатита В. Целью изобретения является получение рекомбинантного вируса осповакцины, индуцирующего поверхностный антиген вируса гепатита В и пригодного для вакцинации людей. С помощью плазмиды pVAX2, состоящей из вектора pVAR15 и гена поверхностного антигена вируса гепатита В (Sгена), последний переносится в геном вируса осповакцины - вариант штамма Листер -ЛИВП, обладающий низкой нейровирусолентностью для кроликов и мышей и широко апробированный на людях (он привит более чем 1,5 млрд. человек). Полученный рекомбинат ЛИОГЕН - НВ/С2 - ТК^- индуцирует HBsAg в зараженных клетках и обладает tk^- фенотипом. Для восстановления tk⁺ фенотипа в HindIIIF фрагмент генома рекомбината ЛИОГЕН - НВ/С2 ТК^- введен тимидинкиназный ген вируса простого герпеса I и получен рекомбинат ЛИОГЕН - НВ/С - ТК⁺. 2 с.п. ф-лы.

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PVAX2 ДЛЯ ПЕРЕНОСА И ЭКСПРЕССИИ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ГЕНА ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В И ШТАММ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В.