Питательная среда для культивирования калуссной ткани бегонии краснолистной Советский патент 1992 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей. Область применения - сельское хозяйство, в частности цветоводство закрытого грунта; медицинская промышленность (получение нового вида сырья биологически активных веществ растительного происхождения для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов).

Известно применение состава среды Мурасиге и Скуга для индуцирования кал- лусной ткани бегонии гибридной.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному составу питательной среды для пассирования каллусной ткани, является вышеуказанный состав среды. Недостатком ее является сложность состава и низкий выход биомассы неорганизованно растущей ткани из-за высокой пролиферации каллуса.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы каллуса.

Указанная цель достигается культивированием каллусной ткани бегонии красно- листной в закрытой емкости в темноте при температуре 25° С и относительной влажности 70% на агаризованной модифицированной питательной среде следующего соста- з

ва, мг/л

Макроэлементы:(/)

Натрий фосфорнокислый/

однозамещенный170

Азотнокислый аммоний1650

Кальций хлористый440 ,

Калий азотнокислый1900

Магний сернокислый370 Калий фосфорнокислый

однозамещенный170 Железо сернокислое закисное 27,8

2 ЕДТА37 3 Микроэлементы:

Борная кислота6,2

Марганец сернокислый22,3

Цинк сернокислый8,6

Калий йодистый0,83

Хлорид кобальта0,025

Купорос медный0,025

Натрий молибденовокислый0,25 Витамины:

Пиридоксин0.1

Тиамин0,1

Никотиновая кислота0,5

Инозитол40

х ON

Ю

Ю

Сахароза

Дрожжевой экстракт

6-БАП

2,4-Д

Агар

30000

40

0,2

1

6000

Вода бидистиллированная 1 л

Внесение в питательную среду 2,4-Д защищает натуральные ауксины ткани от разрушения и делает возможным ее рост. 6-БАП в сочетании с 2,4-Д обладает сильным действием индукторов роста каллусной ткани. Повышение уровня ауксина (2,4-Д) приводит к гипертрофии клеток и угнетению роста ткани, дедифференциации и образованию корней. Преобладание 6-БАП способствует образованию побегов. Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Для получения в пересадочной культуре гомогенно растущей биомассы каллусной ткани бегонии краснолистной использовали три модификации питательной среды предлагаемого нами состава с различным соотношением фитогормонов: 6-БАП 0,2 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л; 6-БАП 0,4 мг/л, 2,4-Д 2 мг/л; 6-БАП 0,1 мг/л, 2,4-Д 0,5 мг/л.

Для приготовления питательной среды используют химически чистые реактивы (классификации ч, хч, чда) и бидистиллиро- ванную воду. В тщательно вымытую и высушенную посуду (250 мл химические колбы) разливают по 50 мл питательной среды. Колбы закрывают ватномарлевыми пробками, автоклавируют в автоклаве для уничтожения микроорганизмов при 0,7-0,8 атм 15 мин. Инструмент (пинцеты, скальпеля) стерилизуют в суховоздушном шкафу при 180° С, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе перед началом работы инструменты опускают в спирт и обжигают в пламени спиртовки. Каллусную ткань пассируют, удаляя опробковевшие некротизированные участки. Культивирование каллусной ткани проводится в термостате при 25° С в условиях непрерывной темноты.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Основное количество биомассы накапливается между 21 и 28 сутками культивирования, а затем ткань переходит к фазе замедленного роста и к 42 суткам ее рост практически прекращается. При дальнейшем культивировании к 45 суткам проявляются некрозы, ткань темнеет и теряет способность к дальнейшему росту. Оптимальным по накоплению биомассы каллусной ткани бегонии краснолистной является 28 суточный цикл культивирования на предлагаемой нами среде. Поэтому концентрации всех компонентов среды даны в абсолютных величинах.

Применением предлагаемого состава среды достигается следующее:

Обеспечение направленной регуляции процессов морфогенеза.

На модифицированной среде - рост неорганизованно растущей каллусной ткани.

Эталон (на среде Мурасиге и Скуга) - пролиферация каллусной ткани.

Оптимизация цикла пассирования кал- 0 лусной ткани.

На модифицированной среде - 28 дней.

Эталан (на среде Мурасиге и Скуга) - 15 дней.

Повышение ростового индекса каллус- 5 ной ткани за 28 дней.

На модифицированной среде - 14,5

Эталон (на среде Мурасиге и Скуга) - 0,33

Увеличение выхода сырой биомассы 0 каллусной ткани за 28 дней.

На модифицированной среде - 16,7 г/л

Эталон (на среде Мурасиге и Скуга) - 0,4 г/л.

Формула изобретения 5Питательная среда для культивирования каллусной ткани бегонии краснолистной, содержащей натрий фосфорнокислый однозамещенный,азотнокислый аммоний, кальций хлористый, калий азотнокислый, 0 магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, железо сернокислое закисное, 2 ЕДТА, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, хлорид кобальта, купорос мед- 5 ный, натрий молибденовокислый, агар, воду бидистиллированную, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода биомассы каллуса, она дополнительно содержит пиридоксин, тиамин, никотиновую 0 кислоту, инозитол, сахарозу, дрожжевой экстракт, 6-БАП, 2,4-Д при следующем соотношении компонентов, мг/л:

Натрий фосфорнокислый

однозамещенный170;

5Азотнокислый аммоний1650;

Кальций хлористый440;

Калий азотнокислый1900;

Магний сернокислый370;

Калий фосфорнокислый 0 однозамещенный170;

Железо сернокислое закисное 27,8;

2 ЕДТА37.3;

Борная кислота6,2;

Марганец сернокислый22,3;

5Цинк сернокислый8,6;

Калий йодистый0,83;

Хлорид кобальта0,025;

Купорос медный0,025;

Натрий молибденовокислый0,25;

Пиридоксин0,1;

кислота

стракт

0,1; 40;

30000; 40; 0,2; 5

2,4-Д1

Агар6000:

Инозитол40;

Вода бидистиллированная1 л.

Использование, биотехнология, культивирование тканей и клеток, фармакология, медицина. Сущность изобретения: в питательную среду, содержащую необходимый набор источников азота, фосфора, калия, углерода дополнительно вводят витамины и фитогармоны. 1 табл.