ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A61K35/74 C12R1/23 

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии и может быть использовано для применения в качестве биологически активных добавок для профилактики и коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. Целью изобретения является получение нового штамма Lactobacillus acidophilus №9-ПС (регистрационный номер RCAM01850), отвечающего современным требованиям, предъявляемым к компонентам кисломолочных лечебно-диетических продуктов, и обладающего высокой биохимической активностью. Штамм Lactobacillus acidophilus №9-ПС выделен из коллекционных культур, является хорошим кислотообразователем, способен ингибировать условно-патогенные микроорганизмы.

Настоящее изобретение относится к биологически чистой культуре штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus №9-ПС, которая по ряду полезных качеств может быть использована в качестве продуцента препаратов-эубиотиков и кисломолочных лечебно-профилактических продуктов питания.

Молочнокислые бактерии и лактобациллы, в частности, являются ключевыми представителями облигатного микробиоценоза здорового организма и распространены, начиная с кожных поверхностей, от ротовой и заканчивая анальной полостями включительно. Именно в верхних отделах кишечного тракта паразитирует основная масса патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Антагонизм лактобацилл, ведущими звеньями которого является интенсивность кислотообразования, способность к продукции антибиотических веществ, обусловливает их использование в качестве биологических препаратов естественного происхождения. Лактобациллы продуцируют нуклеазы, лизоцим, витамины, усиливают активность макрофагов в организме, стимулируют секрецию антител, цитокинов, что в значительной степени способствует повышению общей иммунологической реактивности организма и установлению симбиотических отношений с бифидо- и колибактериями [1].

Увеличение арсенала эффективных и доступных бактериальных препаратов и совершенствование существующих связано с необходимостью получения новых высокоактивных штаммов лактобацилл. Важное значение имеет интенсивность кислотообразования, а также фенотипические характеристики штамма, такие как его способность развиваться при повышенной осмотической активности среды, ростовые свойства и морфометрические параметры клеток. Последние имеют значение в технологии промышленного получения биопрепаратов, поскольку удельный выход биомассы с крупными клетками заведомо ниже, чем с мелкими.

Предлагаемый штамм Lactobacillus acidophilus №9-ПС новый, в научной и патентной литературе не описан.

За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе штаммов лактобактерий вида Lactobacillus acidophilus (патент США №3639666; патент Франции №2622452; патент Швейцарии №637297; патент ФРГ №2421066; патент Японии №05227946).

Однако штаммы лактобактерий зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание преимущественно лечебно-профилактических препаратов и биологически активных добавок к пище в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные штаммы имеют существенные недостатки, если их использовать для приготовления препаратов и кисломолочных продуктов в жидкой форме: малые сроки хранения указанных препаратов и продуктов, низкие органолептические качества, которые несущественны для препаратов в сухой форме.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 5ДС, используемый в производстве кисломолочных продуктов, предусматривающих получение Lactobacillus acidophilus, способного активно развиваться в молоке при пониженных температурах культивирования. Однако штамм характеризуется невысоким пределом кислотообразования [2].

В отличие от прототипа предлагаемый штамм при оптимальном режиме культивирования характеризуется устойчивым свойством биосинтеза внеклеточных вязких углевод-белковых комплексов, способностью активизировать рост слизистых культур молочнокислых стрептококков и стабилизировать их по основным биохимическим свойствам, а также высокой кислотностью.

Идентификацию штамма проводили по основным морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим свойствам согласно Определителю Берджи [3].

Для проверки чистоты культур был произведен посев коллекционного образца на агар MRS и инкубация его в течение 24 часов.

Морфология. При культивировании в жидкой селективной среде MRS образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 часа. На плотной среде MRS образует круглые колонии с неровными краями, гомогенные, непрозрачные, пигмента не образуют, профиль колоний плоский, без блеска, легко снимаются петлей с поверхности плотной питательной среды.

В мазках клетки имеют вид коротких и длинных прямых палочек с закругленными концами, размером 0,7-0,9×1,4-7, расположены одиночно или в виде коротких цепочек. Окрашиваются грамположительно. Неподвижны. Спор и капсул не имеет. При окрашивании метиленовой синью в клетках наблюдаются четко выраженные метахроматические зерна.

Физиолого-биохимические свойства. Тип брожения - гомоферментативный с образованием DL-молочной кислоты. Гидролизует эскулин. Ферментирует амигдалин, целлобиозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мальтозу, салицин, сахарозу, трегалозу. Растет на жидких питательных средах: мясопептонный бульон с добавлением 1-2% глюкозы или лактозы, гидролизованное молоко, молочная сыворотка и на тех же средах с агаром (табл.1).

Таблица 1 Оценка способности штамма Lactobacillus acidophilus №9-ПС утилизировать различные субстраты, % Субстат Lactobacillus acidophilus №9-ПС D-фруктоза 100 D-галактоза 100 Эскулина цитрат 99 D-целлобиоза 95 D-мальтоза 100 D-лактоза 70 D-сахароза 100 D-трегалоза 80 Инулин 0

Факультативный анаэроб. Каталазу не образует. Индол и скатол не образует. Желатин не разжижает. Не обладает гемолитической активностью.

Оптимальная температура роста 35-38°C. Хорошо растет в гидролизованном молоке с pH 5,8. Время свертывания 18 часов. Количество колониеобразующих единиц на грамм исследуемого материала (КОЕ/г) до 1·10¹⁰ КОЕ/г. Кислотность 120° (по Тернеру).

Поддержание штамма.

Методы хранения: на жидкой питательной среде при 5-6°C; лиофилизированная культура при -18…-24°C

Среды хранения: гидролизованное молоко, агар MRS, жидкая среда MRS.

Среды культивирования: молоко коровье, цельное, нормализованное или обезжиренное, мясопептонный бульон с добавлением 1-2% глюкозы или лактозы, молочная сыворотка, лактоагар, агар MRS, жидкая среда MRS, мясопептонный агар.

Температура культивирования: 32-40°C.

Время инкубации: 18-24 ч в зависимости от температуры инкубации, частота пересевов 1 раз в месяц. Высокая активность штамма относительно стабильна при длительном хранении три года в лиофилизированном состоянии (табл.2).

Таблица 2 Характеристика штамма Lactobacillus acidophilus №9-ПС Показатели Характеристика Консистенция и внешний вид Однородная консистенция, вязкая, очень тягучая Вкус и запах Кисло-молочный, специфический для ацидофильной палочки, без посторонних привкусов и запахов Цвет Белый или слегка кремовый оттенок Время свертывания молока, при внесении в молоко 1,5-2% жидкой закваски, час 12-18 ч Температура при сквашивании, °C 38-40 Количество молочнокислых бактерий в 1 мл 10⁹-10¹⁰ Кислотность в молоке, °T предельная 120 Заселение слизистой пищеварительного тракта и толстой кишки Сохраняется Сохранение нормального биоценоза кишечника Сохраняется Хранение в жидком виде в холодильнике при +5 - +6°C 90-95% живых клеток Частота пересевов на жидких питательных средах 1 раз в месяц

Использование штамма иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Изучение кислотообразующей активности штамма Lactobacillus acidophilus №9-ПС.

Активность кислотообразования определяли титрометрическим методом. С этой целью по 1 мл 1-миллиардной взвеси суточной культуры лактобактерий вносили в пробирки с 9 мл жидкой среды MRS и культивировали при 37,5°C в анаэростатах, продутых газовой смесью. Через 48-72-168 часов от начала культивирования вынимали по две пробирки, из которых отбирали по 5 мл культуральной жидкости и титровали ее 0,1 н. раствором щелочи. Количество щелочи, пошедшей на титрование, соответствует количеству образуемой 0,1 н. кислоты в 5 мл культуральной жидкости. Окончательный результат выражали в градусах Тернера: T°=A·K·20, где A - количество 0,1 н. щелочи, пошедшее на титрование 5 мл исследуемой жидкости, K - поправка к титру, определяемая при титровании 0,1 н. раствора щелочи 0,1 н. янтарной кислотой, T° - величина, выражающая количество 0,1 н. щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца. В результате проведенных исследований установлено, что к 48 часам происходило значительное закисление культуральной жидкости до 120°T. Исходя из полученных данных, было выявлено, штамм Lactobacillus acidophilus №9-ПС обладает высокой кислотообразующей активностью.

Пример 2. Для приготовления производственной закваски в стерилизованное при 1 атм в течение 15 минут молоко вносят порцию закваски - 1,0% и выдерживают при 38-40°C в течение 4-5 ч до образования сгустка. Количество колониеобразующих единиц на 1 грамм исследуемого материала до 1010 КОЕ/г, кислотность 80-100° (по Тернеру). Сгусток однородный, вязкий, тягучей консистенции. Цвет белый, вкус кисломолочный, запах приятный, специфический для ацидофильной палочки.

Пример 3. Изучение влияния жидкой культуры штамма Lactobacillus acidophilus №9-ПС на биоценоз кишечника.

Количественный и качественный состав микрофлоры кишечника цыплят кросса Смена (по Знаменскому В.А., 1986), индекс стабильности микрофлоры (отношение суммарного количества бифидо- и лактобактерий к количественному показателю кишечной палочки) определяли на 0, 15, 30 и 45-е сутки опыта. До применения штамма Lactobacillus acidophilus №9-ПС из содержимого фекалий цыплят кросса Смена выделяли 42% Е. coli, 35% бифидобактерий и 23% лактобацилл. У цыплят опытной группы кросса Смена в 15-суточном возрасте относительно контроля статистически значимо возрастало количество лактобацилл на 15,9%, уменьшалось количество кишечной палочки на 11,3%, количество бифидобактерий не отличалось от такового у цыплят контрольной группы. В 30-суточном возрасте у цыплят опытной группы количество лактобацилл было выше относительно аналогов из контроля на 14,5%, количество E. coli было ниже на 4,2% (P<0,05). В 45-суточном возрасте у цыплят опытной группы количество лактобацилл было выше на 12,1 (P<0,1), E. coli ниже на 12,4% (P<0,05). Индекс стабильности микрофлоры был выше у цыплят опытной группы на 13,8%. Следовательно, штамм Lactobacillus acidophilus №9-ПС способствует ускорению процесса заселения кишечника полезной микрофлорой и качественным изменениям микробного пейзажа в кишечнике. Сохранение нормального биоценоза кишечника наблюдается и после прекращения применения закваски.

Список литературы

1. Н.Н. Мальцева, М.М. Шкарупета и др. Иммуномодулирующие свойства некоторых микробов - представителей нормальной микрофлоры кишечника. // Антибиотики и химиотерапия, 1992. - Т.37, №12. - С.41-43.

2. Авторское свидетельство СССР №1266858, кл. C12N 1/20, 1986 (прототип).

3. Определитель бактерий Берджи: Справ. изд.: Пер. с англ.: B 2 т. Т.2 / Под ред. Дж. Хоулта и др. - 9-е изд. - М.: Мир, 1997. - С.437-796.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus acidophilus №9-ПС обладает биохимической активностью и высокой кислотностью. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под регистрационным номером RCAM01850. Штамм может найти свое применение для профилактики и коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. Изобретение позволяет увеличить рост слизистых культур молочнокислых бактерий и ускоряет процесс заселения кишечника полезной микрофлорой. 2 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus RCAM01850 - компонент бактериальной закваски для приготовления кисломолочных лечебно-диетических продуктов.