СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРОФРУКТОЗЫ Российский патент 2001 года по МПК C13K11/00 C12P19/02 C12N1/20 

Описание патента на изобретение RU2171294C1

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа получения дейтерофруктозы (фруктозы, содержащей в молекуле вместо атомов водорода 1H атомы его стабильного изотопа дейтерия - 2H или D).

Препараты дейтерофруктозы применяют при изучении углеводного и липидного метаболизма? что позволяет упростить диагностику ряда заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ.

В заявляемом изобретении предложен способ получения дейтерофруктозы путем микробиологического синтеза дейтерополифруктанов с их последующим гидролизом до дейтерофруктозы. Сведений о получении дейтерофруктозы путем микробиологического синтеза в научной и патентной информации нами не обнаружено.

Изобретение является новым и не имеет аналогов.

В предлагаемом изобретении для микробиологического синтеза дейтерополифруктанов используют бактерии вида Methylobacillus flagellatum. На основе бактерий штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-4295 путем многоступенчатой селекции получен штамм, отличающийся способностью расти на питательной среде, приготовленной на основе тяжелой воды и содержащей дейтерометанол в качестве источника углерода. Отобранный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов как Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823.

Бактерии штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 имеют следующие морфологические и физиолого-биохимические особенности: подвижные палочки 1,8х0,6 мкм, спор не образуют, через 2-3 дня роста на твердой питательной среде образуют гладкие матовые серовато-желтые колонии, с ровным краем. Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 облигатный метилотроф, аэроб, прототроф, нейтрофил, растущий при 35-40oC, усваивает азот в форме солей аммония. При росте на питательной среде, содержащей дейтерометанол, тяжелую воду и минеральные соли, бактерии Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 синтезируют до 110 мг/л дейтерополифруктанов. До полугода бактерии этого штамма можно хранить на твердой питательной среде такого же состава в бакпечатках при 6-10oC, для длительного хранения используют лиофилизированные культуры.

Способ получения дейтерофруктозы осуществляют следующим образом. Бактерии Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 культивируют на питательной среде, содержащей дейтерометанол, в качестве источника углерода, тяжелую воду и минеральные соли. При росте на такой среде эти бактерии продуцируют внеклеточные дейтерополифруктаны, которые накапливаются в культуральной жидкости. По окончании процесса культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы центрифугированием. Дейтерополифруктаны осаждают избытком ацетона и гидролизуют в кислых условиях до образования дейтерофруктозы, которую выделяют путем выпаривания под вакуумом до получения сухого продукта. Выход дейтерофруктозы составляет 80-100 мг/л культуральной жидкости. Уровень примесей дейтеромоносахаров определяют методом жидкостной хроматографии. Уровень дейтерирования целевого продукта - дейтерофруктозы определяют методом протонной ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Для культивирования бактерий Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 используют питательную среду следующего состава, г/л [5]: дейтерометанол (CD3OD 99,5 ат.% D) - 5,6, Na2HPO4 - 6,0, KH2PO4 - 3,0, NaCl - 1,0, NH4Cl - 1,0, CaCl2 - 0,02, MgSO4 - 0,04, Na2ЭДТА - 0,015, Na2MoO4 - 0,0001, MnCl2 - 0,0001, ZnSO4 - 0,0003, CuCl2 - 0,0003, CoCl3 - 0,0006, Fe2SO4 - 0,0006, H3BO3 - 0,0009, NiCl2 - 0,00006, тяжелая вода (2H2O 99,85 ат.% 2H), pH - 7,0-7,1.

Посевную культуру выращивают в пробирках, заполненных на 1/8 часть объема питательной средой на качалке при 200 об/мин в течение ночи. Колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл стерильной питательной среды, засевают, перенося в них содержимое пробирок, и культивируют 50 ч при 37oC. Для предотвращения разбавления дейтериевой метки среды влагой атмосферы пробирки и колбы закрывают пробками, снабженными хлор-кальциевыми трубками. Культуральную жидкость с содержащимися в ней дейтерополифруктанами отделяют от биомассы центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин. Дейтерополифруктаны осаждают добавлением при интенсивном перемешивании охлажденной культуральной жидкости к двойному объему охлажденного ацетона. Выпавшие в течение 18 ч белые хлопья дейтерополифруктанов отделяют центрифугированием (16000 об/мин в течение 40 мин). Выход дейтерополифруктанов с 1 л питательной среды составляет 110 мг. Таким образом, конверсия дейтерометанола в дейтерополифруктаны - 1,96%.

Гидролиз дейтерополифруктанов (110 мг) проводят в 15 мл 2н. H2SO4 в течение 2ч при 100oC. Гидролизат нейтрализуют Ca(OH)2, выпавший осадок CaSO4 отделяют центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин). Надосадок выпаривают досуха под вакуумом. Вес полученной дейтерофруктозы составляет 100 мг. Таким образом, конверсия дейтерометанола в дейтерофруктозу - 1,78%.

Определение моносахаридного состава дейтерополифруктанов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Waters", снабженном дифференциальным рефрактометром R401, колонкой Separon SGX NH2 (150 мм х 3,3 мм) в изократическом режиме с использованием в качестве элюента системы ацетонитрил:вода в соотношении 3:1. Сопоставление хроматограмм мономеров гидролизата дейтеро-полифруктанов с хроматограммами стандартов наиболее распространенных сахаров (арабиноза, рибоза, фруктоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) показало, что синтезированные дейтерополифруктаны состоят преимущественно из дейтерофруктозы с примесью дейтерорибозы - 2%.

Определение уровня дейтерирования дейтерофруктозы методом протонной ЯМР-спектроскопии проводят путем исследования ацетилированных производных (пентаацетатов) продуктов гидролиза дейтерополифруктанов. Для получения пентаацетатов к 1 мл охлажденного до 0oC 1,0%-ного раствора свежеплавленного хлористого цинка в уксусном ангидриде прибавляют равный объем гидролизата дейтерополифруктанов, смесь энергично перемешивают до полного растворения сахара (4-5 ч), выдерживают 1 ч при 20-25oC и 2 ч при 50oC. Раствор, охлажденный в ледяной бане, перемешивают с 10 мл воды со льдом в течение 2 ч и нейтрализуют избытком бикарбоната натрия. Раствор трижды экстрагируют хлороформом (по 10 мл), объединенный экстракт промывают водой, высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают под вакуумом. Полученный таким образом сиропообразный остаток растворяют в 5 мл абсолютного эфира и оставляют на ночь при 10oC. Пентаацетат дейтерофруктозы выделяют при перекристаллизации из спирта с добавлением хлороформа (2 об.%). Результаты анализа ЯМР-спектора пентаацетата полученной дейтерофруктозы свидетельствуют, что уровень дейтерирования целевого продукта - дейтерофруктозы составляет 89%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получать до 100 мг/л дейтерофруктозы с уровнем включения дейтерия не менее 89%. Примесь дейтерорибозы - не более 2%.

Похожие патенты RU2171294C1

название год авторы номер документа
ФРАГМЕНТ ДНК РСХ-302, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ СЕКРЕТИРУЕМОЙ ЭНДО-(1-4)-БЕТА-КСИЛАНАЗЫ PENICILLIUM CANESCENS И ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS - ПРОДУЦЕНТ СЕКРЕТИРУЕМОЙ ЭНДО-(1-4)-БЕТА-КСИЛАНАЗЫ 2001
  • Винецкий Ю.П.
  • Вавилова Е.А.
  • Серебряный В.А.
  • Чулкин А.М.
RU2197526C1
ШТАММ BACILLUS THURINGIENSIS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОТОКСИНА ПРОТИВ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ И СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 1995
  • Азизбекян Р.Р.
  • Азизбекян Р.Р.
  • Гулько М.А.
  • Миненкова И.Б.
  • Соколов А.К.
RU2108384C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS H8, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ БОРЬБЫ С ЖЕСТКОКРЫЛЫМИ НАСЕКОМЫМИ 2001
  • Азизбекян Р.Р.
  • Кузнецова Н.И.
  • Миненкова И.Б.
  • Смирнова Т.А.
  • Шагов Е.М.
  • Шамшина Т.Н.
RU2204598C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM FLAVUM - ПРОДУЦЕНТ L-ГЛУТАМИНА (ВАРИАНТЫ) 1994
  • Леонова Т.В.
  • Жданова Н.И.
  • Кузнецова Н.Н.
  • Балицкая Р.М.
  • Гусятинер М.М.
  • Ясиновский В.Г.
RU2084520C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM - ПРОДУЦЕНТ Н-БУТАНОЛА 2011
  • Сушкова Валентина Ивановна
  • Яроцкий Сергей Викторович
RU2458118C1
СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА Н-БУТАНОЛА 2009
  • Сушкова Валентина Ивановна
  • Яроцкий Сергей Викторович
RU2406763C1
ШТАММ STREPTOMYCES FRADIAE - ПРОДУЦЕНТ ТИЛОЗИНА 1992
  • Жданов В.Г.
  • Юстратова Л.С.
  • Ярославцева Н.Г.
RU2018536C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS SPP THURINGIENSIS ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЭКЗОТОКСИНСОДЕРЖАЩИХ БИОИНСЕКТИЦИДОВ 1993
  • Кузнецова Н.И.
  • Королева Ю.В.
  • Григорьева Т.М.
  • Азизбекян Р.Р.
  • Дебабов В.Г.
RU2061376C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ 2013
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2539092C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ Clostridium acetobutylicum - ПРОДУЦЕНТ н-БУТАНОЛА 2011
  • Сушкова Валентина Ивановна
  • Яроцкий Сергей Викторович
RU2455350C1

Реферат патента 2001 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРОФРУКТОЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения дейтерофруктозы. Способ предусматривает культивирование бактерий штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 на питательной среде, содержащей дейтерометанол в качестве источника углерода, тяжелую воду и минеральные соли. Бактерии штамма-продуцента, отобранного как форма, адаптированная к тяжеловодной среде, синтезируют на таких средах дейтерополифруктаны, состоящих из мономеров дейтерофруктозы с примесью дейтерорибозы (2%). После выделения дейтерополифруктанов из культуральной жидкости и их гидролиза выделяют целевой продукт - дейтерофруктозу в сухом виде. Способ позволяет получать до 100 мг/л дейтерофруктозы с уровнем включения дейтерия не менее 89%.

Формула изобретения RU 2 171 294 C1

Способ получения дейтерофруктозы, предусматривающий культивирование бактерий штамма Methylobacillus flagellatum ВКПМ В-7823 на питательной среде, содержащей дейтерометанол в качестве источника углерода, тяжелую воду и минеральные соли, отделение культуральной жидкости от биомассы, осаждение содержащихся в ней дейтерополифруктанов, их кислотный гидролиз до образования дейтерофруктозы и ее выделение путем выпаривания до получения сухого продукта.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2001 года RU2171294C1

Аналоги изобретения не обнаружены.

RU 2 171 294 C1

Авторы

Складнев Д.А.

Цыганков Ю.Д.

Мишина И.М.

Даты

2001-07-27Публикация

2000-02-10Подача